CAT#:JW-221160-50
常温运输和保存

血液线粒体DNA提取试剂盒（沉淀法）

产品及特点
本产品是在本公司血液DNA提取产品基础上开发的、专门用于从新鲜或冷冻的人抗凝全血中提取线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）的试剂。人血液中的细胞分类如下：

人血液中红细胞与白细胞的数量比例为1000-6000：1，但红细胞中没有DNA，故所提线粒体DNA主要来源于白细胞。白细胞分多型核白细胞（Polymorphonuclear Leukocytes，PMNs）和外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）两类细胞，前者包括占白细胞总数50-70%的中性粒细胞Neutrophils，0.5-5%的嗜酸性粒细胞Eosinophils和0-1%的嗜碱性粒细Basophils。后者包括占白细胞总数20-40%的淋巴细胞Lymphocyte（T细胞、B细胞和NK细胞），1-8%的单核细胞Monocyte和0.3-0.9%的树突状细胞Dendritic Cell。
本试剂盒具有下列特点：
1.DNA产率高。如果样本为新鲜血液，线粒体DNA产率最高可以达到1 mg/mL新鲜血液。如果样本为冻存血液，DNA产率差别较大。
2.DNA纯净，OD260/OD280在1.8-2.0之间。
3.可直接用于PCR、酶切、杂交等实验。
4.适用于哺乳动物血液，不适用于其他动物血液。
5.本产品足够使用50次，每次可以处理3mL抗凝血液。
6.每1×10E7个白细胞可以纯化到40-80ng mtDNA。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
成分                                                            编号       规格        包装
10×红细胞裂解液（DNA纯化用）           220171     15mL        15mL本色瓶
冻存血液红细胞裂解液（DNA纯化用）   230505     250mL×2    250mL本色瓶
白细胞洗涤液                                           221160d    100mL       120mL本色瓶
线粒体DNA提取溶液A                              221160a    7.5mL       10mL本色瓶
线粒体DNA提取溶液B                              221160b    15mL       15mL本色瓶
线粒体DNA提取溶液C                              221160c    12mL       15mL本色瓶
去蛋白溶液                                               230507      50mL       50mL棕玻瓶
微量核酸沉淀剂（IPA型）                        230506      50mL      60mL本色瓶
DNA洗脱液（基因组纯化专用）               220125     10mL        10mL本色瓶
使用手册                                                   221160sc    1 份        无
本产品使用大扁盒包装

运输及保存
常温运输和保存，保存期限一年。

自备试剂
1.5mL塑料离心管，75%乙醇。

使用方法
一、新鲜血液白细胞的分离
本试剂盒只提供基于全血红细胞裂解法的白细胞制备试剂。由于有很多方法（如自然沉降法、差异沉淀法、Ficoll分离法，氯化铵分离法等）从新鲜抗凝血液制备白细胞，因此用户可以用自选的方法制备白细胞。如果选择用自备试剂制备白细胞，则本步操作可以跳过。
1.将3mL人新鲜抗凝血液转移到一个干净的15mL塑料离心管中。
2.按照10：1的比例加入0.3mL红细胞裂解液（DNA纯化用）；轻柔颠倒数次混匀，静置10分钟（期间可轻柔颠倒混匀几次）。注意：红细胞裂解液（DNA纯化用）一旦打开后，非常容易污染细菌，未用完的部分最好-20℃保存，下次使用前，要溶解后充分摇匀。
3.室温下500 g离心8分钟沉淀白细胞核。上清将呈现红色，这是红细胞裂解后释放出血红蛋白的颜色。弃上清。
4.在沉淀中加入1mL的白细胞洗涤液，轻柔重悬白细胞沉淀得到白细胞重悬液。
5.离心500g 8分钟，弃上清。在沉淀中加入1mL 的白细胞洗涤液，轻柔重悬白细胞沉淀得到白细胞重悬液。
6.对白细胞重悬液进行细胞计数。由于人白细胞浓度差异比较大（新生儿童为15-20×E10个/mL，半岁到2岁儿童为11-12×E10个/mL，4-14岁为8×E10个/mL，成人为4-10×E10个/mL，mL指血液体积），故需要从下步开始使用固定细胞数。
7.将1×10E7个白细胞转移到1.5mL塑料离心管，1500g离心4分钟，弃上清，白细胞将形成沉淀。
8.所得白细胞沉淀可以直接用于DNA提取，也可放置在-20℃待用。

二、线粒体DNA的提取
9.在白细胞沉淀中加150mL线粒体DNA纯化溶液A，用移液枪吹打数次混匀后放冰上。
10.再加入300mL线粒体DNA纯化溶液B，轻柔颠倒混匀10次。此溶液为蓝色，混匀后混合液的蓝色将变得均匀。冰上准确放置8分钟。
11.再加入225mL线粒体DNA纯化溶液C，轻柔颠倒混匀10次，混合液将变成无色。冰上准确放置25分钟。如果颜色异常，需要停止实验，分析原因。
12.在4℃下13000g离心20分钟。
13.将上清（含线粒体DNA）转移到一只新的1.5mL塑料离心管中。
14.加入等体积的去蛋白溶液，涡旋震荡3分钟混匀。
15.室温13000 g离心5分钟，转移无色的水相到一只新的1.5mL塑料离心管中，不要取蓝色的液体。
16.在无色的上清中加入等体积的微量核酸沉淀剂（IPA型），颠倒10次混匀，室温13000 g离心10分钟，去尽上清，注意不要触及管底微量沉淀。
17.加入1mL自备的 75%乙醇，充分混匀后室温13000g 离心3分钟，去尽上清，注意不要触及管底微量沉淀。
18.重复上步一次。
19.短暂离心，去尽残留溶液大约50mL（此步十分重要，不要省略）。
20.短暂晾干半分钟，加入50mL DNA洗脱液（基因组专用）溶解DNA。一般能得到40-80ng mtDNA。
21.溶解后的DNA可以立即用于后续的OD检测、酶切、PCR或其他实验，也可以放置在-20℃长期保存。如果需要更多mtDNA，可以使用滚环扩增法进行扩增。

三、冻存血液线粒体DNA的纯化
22.将冻存血液放37℃水浴化冻。
23.将2mL 抗凝新鲜血液转移到一个干净的15mL塑料离心管中。
24.加入4倍体积（8mL）的冻存血液红细胞裂解液（DNA纯化用），台式摇床上轻柔摇晃10分钟混匀。注意：冻存血液红细胞裂解液（DNA纯化用）一旦打开后，非常容易污染细菌，未用完的部分最好-20℃保存，下次使用前，要溶解后充分摇匀。
25.在4℃ 1000 g离心4分钟，转移上清到新的离心管中。
26.将上清在4℃ 12000 g离心10分钟，弃上清，保留沉淀。
27.接第7-19步进行线粒体DNA纯化。
注意：由于陈旧血液在冻凝过程中冰晶已经对细胞核膜和线粒体膜产生损伤，所以离心得到的白细胞不能洗涤。同时由于有很多线粒体被冰晶刺破，线粒体DNA已经流失，故其得率会比新鲜血液线粒体DNA少，具体减少多少跟冻凝时间长短有关。

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