CAT#:JW-221162-15
一常温运输和保存，但有一成分需要低温运输和保存

植物叶绿体RNA纯化试剂盒

产品及特点
植物叶绿体是重要的细胞器，负责光合作用，具有独立的基因组DNA和独立的RNA转录系统，是重要的研究材料。本试剂盒专门用于植物叶绿体RNA的快速提取。它具有下列特点：
1.纯度高，不含污染和抑制剂。
2.得到的叶绿体RNA可以直接用于RT-PCR等后续分子生物学实验。
3.本产品足够15次提取，每次可处理30g叶片。
4.已经成功用于菠菜，大豆，莴笋，白菜，烟草和甜菜等双子叶植物，也适用于单子叶等其他植物（可能需要优化条件）。

规格及成分
本试剂盒第一部分，编号221162pt1，采用大纸盒包装，常温运输和保存
成份                                          编号            规格            包装
叶绿体纯化匀浆液成分一    211255a1    250mL×2     250 mL本色瓶
Percoll                                211251         60 mL          60 mL本色瓶
带柄尼龙筛                         220341         1个                自有包装
软毛笔                                220342          1只                无包装
细胞器RNA纯化溶液A        230348a       15 mL         15 mL棕色玻璃瓶
细胞器RNA纯化溶液B        230348b         3 mL          3 mL棕色玻璃瓶
细胞器RNA纯化溶液C        230348c        15 mL       15 mL本色瓶
RNA洗脱液                         211256          10 mL      10 mL本色瓶
使用手册                            221162sc         1份          无
本试剂盒第二部分，编号221162pt2，塑料袋包装，低温运输，-20℃保存
成份                                          编号          规格          包装
叶绿体纯化匀浆液成分二    211255a2        3g    10 mL本色瓶

运输及保存
常温运输和保存，但叶绿体纯化匀浆液成分二需要。保存期限一年。本试剂盒提供的叶绿体纯化匀浆液成分二需要塑料袋包装，低温运输，-20℃保存。

自备物品
去离子水、Waring匀浆机、75%乙醇

使用方法
注意：叶绿体对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行，离心力以g而不是rpm计算。如果需要研究叶绿体的功能，提取还需要在昏暗的光线条件下进行。强烈建议用显微镜监控整个过程中叶绿体的回收情况。
一：叶绿体的纯化
1.实验前1-2天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成，否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净，再用蒸馏水淋洗，去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理，则保存时需要保持叶片湿润，即使如此，叶片的放置时间也不能超过一天。
2.计算实验所需匀浆液的体积。本试剂盒一次实验可处理30 g叶片，对一般植物，每克叶片需要准备4mL匀浆液，则一次实验需要准备120mL匀浆液。对烟草和大豆，每克叶片需要6mL匀浆液，则一次实验需要准备180mL匀浆液。为了保险最好可以多配10%。
3.实验当天制备匀浆液。制备方法是：将自备的去离子水与叶绿体纯化匀浆液成分一在干净的玻璃或塑料容器中按4：1的比例混合，然后在每100 mL混合液中加入匀浆液成分二干粉0.1g（终浓度为0.1%），轻柔搅拌10分钟后，所得溶液即为匀浆液。冰上预冷待用。匀浆液只能当天使用，不能放置。
4.预留1.5mL匀浆液用于悬浮叶绿体，其余匀浆液转移到Waring匀浆机（即家用制备果汁的匀浆机）中，再快速将新鲜植物叶片的叶脉去除，再将叶片剪成1-3 cm2大小的碎片，浸泡在匀浆机里面的匀浆液中。注意：理论上可用Dounce玻璃匀浆器，Polytron匀浆机和研磨（加玻璃珠）等匀浆，但它们单次处理量小，需分成很多份处理后再汇集，非常不方便，故建议使用Waring匀浆机。
5.低速匀浆10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的叶碎片按入到匀浆机底部，再低速匀浆10秒。
6.用试剂盒提供的带柄尼龙滤筛过滤匀浆液，用预冷的200 mL量筒收集穿透液，再等分到4个预冷的50 mL的塑料离心管中（每个管中的穿透液不要超过35 mL）。带柄尼龙滤筛洗涤干净后可反复使用。
7.在水平转子离心机上4℃ 200 g离心3分钟（对菠菜，白菜和莴笋材料）或400 g离心1分钟（对甜菜材料），白色沉淀为未破裂的细胞或细胞核。其他植物材料则需要用户自己摸索最佳离心力。
8.将上清液（含叶绿体）转移到一个新的、预冷的50 mL塑料离心管中。
9.在水平转子离心机上4℃ 1000 g离心7分钟，小心弃上清，沉淀含叶绿体。
10.在沉淀中加入第4步预留的1.5 mL预冷匀浆液，用软毛笔使叶绿体重悬，如果有白色淀粉沉淀，重悬时避免重悬白色淀粉。注意：重悬时不能要用枪头吹打，否则叶绿体容易破裂。
11.将4管叶绿体重悬液汇集（共约6 mL），得到叶绿体粗提液。
12.如果对叶绿体RNA是否含DNA污染的要求不高，则叶绿体粗提液可以直接用于叶绿体RNA纯化，具体操作是在水平转子离心机上4℃ 1000 g离心7分钟，小心弃上清，沉淀为叶绿体，直接用于RNA纯化（见第二步）。
13.如果需要无细胞核DNA污染的叶绿体RNA，则按以下流程操作：在50 mL塑料离心管中先加入6 mL匀浆液成分一和4 mL的Percoll，充分混合均匀得到40%的Percoll溶液，在其液面上小心铺上6mL的叶绿体粗提液，在水平转子离心机上4℃ 1700 g离心6分钟，管底绿色沉淀为完整的叶绿体，液面的绿色部分为破碎的叶绿体。小心将上清去除后，直接将沉淀（完整叶绿体）用于叶绿体RNA纯化（见第二步）。

二：叶绿体RNA的纯化
14.将1mL细胞器RNA纯化溶液A加入到叶绿体沉淀中后充分吹打混匀。
15.加入0.2mL 细胞器RNA纯化溶液B，震荡混匀10-30秒。
16.室温放置5分钟。
17.14,000 rpm室温离心3分钟。
18.小心转移上清液（约0.7mL）到一个新的1.5 mL离心管中。
19.加入等体积的细胞器RNA纯化溶液C，颠倒混匀后14,000 rpm室温离心10分钟.
20.小心弃上清液。
21.在沉淀中加入自备的75%乙醇，颠倒数次混匀。
22.14,000 rpm室温离心3分钟，弃上清液。
23.空甩半分钟n去除残留液体约50uL。
24.室温开盖放置2-3分钟.
25.加入30uL RNA洗脱液吹打溶解RNA沉淀，取uL在NanoDrop上测OD，计算浓度和回收率，然后立即进入后续实验，或将RNA放-80℃保存。

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