CAT#:JW-221002-50
常温运输和保存

质粒DNA纯化试剂盒（沉淀法）

产品及特点
碱变性法是最常见的质粒DNA提取方法，其过程是首先菌体经离心悬浮后，细胞被SDS和碱裂解，并且碱使基因组DNA和质粒DNA变性，随后用酸中和，质粒DNA可以快速复性，而基因组DNA不能快速复性，故可以通过离心去除。如果用柱式法，则含质粒DNA的上清用离心吸附柱吸附质粒DNA，洗去杂质，得到纯化的质粒DNA。但此方法不适合特别大的质粒。因此本公司推出沉淀法，用于纯化柱式法不能回收的质粒DNA。本产品具有下列特点：
1.快速、步骤少，整个操作在40分钟左右完成。
2.质粒DNA纯化溶液B中有蓝色染料，便于目测非常关键的碱变性和中和反应两步的溶液混匀状况，保证实验效果。
3.产量高，一次可以处理1-5 mL过夜培养的菌液，每毫升过夜培养的菌液可以提取到2-5 mg/mL（取决于质粒是高拷贝、中拷贝还是低拷贝）。
4.本产品足够50次微量提取。
5.纯度高，采用本试剂盒提取的质粒OD比值在1.8-2.0之间，可以直接用于酶切、转化、测序及PCR等。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
成分                                                   编号       规格            包装
质粒DNA纯化溶液A                        221002a    13 mL    30 mL本色瓶
质粒DNA纯化溶液B                        221002b    13 mL    30 mL本色瓶
质粒DNA纯化溶液C                        221002c    18 mL    30 mL本色瓶
RNase A溶液,10 mg/mL                220714        0.6 mL    2 mL蓝盖管
去蛋白溶液                                    221002d        30 mL    30 mL棕色玻璃瓶
质粒沉淀液                                   221002e        30 ml       30 mL本色瓶
DNA洗脱液（基因组纯化专用）    220125        10 mL    10 mL本色瓶
使用手册                                       221002sc        1份            无
本产品采用大纸盒包装

运输及保存
常温运输和保存，RNase A溶液需要-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
75%乙醇

使用方法
1.从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37℃震荡培养12-16小时（摇床转速200-300）。注意：建议使用LB培养基，营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统的处理能力而降低质粒DNA的质量。另外，延长培养时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒DNA浓度降低。
2.用1.5 mL离心管收集1-5 mL过夜培养饱和菌液，室温12,000 rpm离心1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。
3.第一次使用本试剂盒时，先将本试剂盒提供的全部RNase A溶液加入到质粒DNA纯化溶液A（简称溶液A，下同）中，摇匀后再取用，未用完的溶液A放4℃保存。
4.加入250 mL溶液A到第2步得到的细菌沉淀中，用枪头充分吹打使菌体重悬。注意：细胞未充分悬浮会影响后续碱变性，可以使用漩涡振荡器混匀或使用枪头吸头吹打沉淀至完全混匀。
5.加入250 mL质粒DNA纯化溶液B（下面简称溶液B，如果溶液B在低温放置产生沉淀，须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用），温和颠倒4-6次混匀，蓝色将变得均匀并且溶液将变得粘稠。注意：千万不要剧烈振荡，否则基因组DNA断裂产生的片段非常容易污染质粒DNA。
6.冰上放置不超过5分钟。注意：冰上放置不要超过5分钟，否则质粒DNA会有碱损伤。溶液B用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的碱，降低其效率。如果溶液B颜色不是蓝色，则表示变质，应该弃之不用并且跟厂家联系。
7.加入350 mL冰上预冷的质粒DNA纯化溶液C（下面简称溶液C），温和反复颠倒4-6次，溶液将变成无色，将有白色絮状沉淀产生。
8.冰上放置至少5分钟让质粒DNA复性。不能短于5分钟，一般10分钟。
9.12,000 rpm离心3分钟，小心将上清液转移到新离心管中。由于此时的溶液比重较大，部分絮状物悬浮在上清液中属正常现象，吸取上清时避开这些悬浮物即可。如果此步的离心在4℃进行，可减轻沉淀物漂浮。
10.加入0.6mL去蛋白溶液，充分震荡2分钟后常温12，000rpm离心2分钟，取水相（无色）到新离心管中，不要取有颜色的部分。
11.加等体积的质粒沉淀液，颠倒30秒混匀后室温12,000 rpm离心10分钟，质粒DNA将形成沉淀，弃上清。
12.加入1 mL的自备75%乙醇，室温12,000 rpm离心1分钟，弃上清。
13.室温12,000 rpm离心1分钟，取出残留液体（约50mL）。
14.室温短暂放置半分钟。
15.加入DNA洗脱液50-100mL重悬沉淀，即得质粒DNA溶液，可以直接用于后续实验。

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