CAT#:JW-220967-20
常温运输和保存、有低温成分

微量包涵体纯化试剂盒

产品及特点
包涵体（Inclusion Body）是指超表达的蛋白在宿主细胞胞浆内（如果超表达的是胞浆蛋白）或膜间内（如果超表达的是分泌蛋白）凝集形成的无活性的固体颗粒。包涵体形成的主要原因是在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白折叠辅助因子，或环境不适导致无法形成正确的蛋白质次级键。由于包涵体主要由超表达的重组蛋白质组成，因此分离纯化包涵体是分离纯化具有活性的重组蛋白的第一步。本产品就是用于快速地从大肠杆菌宿主中提取高质量的包涵体的试剂盒，它具有下列特点：
1.操作简单快速，整个过程只要三十分钟左右。
2.微量纯化，可以在1.5mL离心管中完成。
3.能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白所占比重达到60%以上。
4.主要用于细菌表达系统，也可用于真菌和真核表达系统，但用户需要自行摸索条件。
5.可以选择盐酸胍和尿素两种蛋白溶解方式。
6.得到的包涵体溶解液可以用于重折叠、SDS-PAGE或其他纯化处理。
7.本产品足够20次微量纯化。

规格及成分
成份                                               编号         规格                          包装材料
微量包涵体纯化溶液A                   220967a    5 mL                      5 mL本色瓶
微量包涵体纯化溶液B                   220967b    50 mL                   60 mL本色瓶
包涵体溶解液                               220967c     5 mL                      5 mL本色瓶
溶菌酶（蛋白级，20 KU/mg）    210808       600 mg（干粉）    2.0 mL本色管
Benzonase溶液（1U/uL）           220969        20 uL                   0.5 mL蓝盖管
使用手册                                       220967sc    1份                        无
本产品使用小扁盒包装

运输及保存
常温运输和保存、溶菌酶和Benzonase需要低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
无

使用方法
一：超声法菌
1.在蛋白诱导期结束时，转移1.5 mL菌液到一个干净的塑料离心管中。最好同时用不加诱导物的细菌做平行对照实验。
2.12,000 rpm室温离心1分钟，小心弃上清。沉淀（约10 mg）放冰上待用或放-80℃保存。
3.加入250 uL冰浴的包涵体纯化溶液A，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则不容易沉淀包涵体。
4.直接进入第14步。

二：酶法裂菌
5.一次微量提取需要250uL包涵体纯化溶液A，用前取包涵体纯化溶液A，按每mL加入120mg溶菌酶的比例加入所需量的溶菌酶并摇晃溶解待用。溶菌酶的溶液非常容易衰变，所以最好现配现用，没用完的只能在-20℃放一周。
6.包涵体中的重组蛋白一般比溶解状态中的蛋白质更能够抵抗微量内源性蛋白水解酶的降解，但如果实验发现得到的重组蛋白确有降解，则需要在包涵体纯化溶液A中新鲜加入自备的蛋白酶抑制剂混合物。
7.在蛋白诱导期结束时，转移1.5 mL菌液到一个干净的塑料离心管中。最好同时用不加诱导物的细菌做平行对照实验。
8.12,000 rpm室温离心1分钟，小心弃上清。
9.加入250 uL含溶菌酶的包涵体纯化溶液A重悬细胞。
10.室温放置20分钟裂解细菌，其间可以用手轻弹离心管混匀。
11.-20℃冷冻至凝固。注意：一定要凝固到细菌溶液变成固体为止。
12.室温水浴解冻。如果裂解充分，细菌释放出的DNA将使裂解物十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要重复冻融步，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。最好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。
13.加入1 uL Benzonase 溶液(1U/uL)，脱色摇床上摇晃直到裂解液不再粘稠，一般需要30分钟左右，否则还需要延长保温时间。
14.12,000 rpm 4℃离心5分钟，留存上清作为SDS-PAGE的对照样品一。
15.将沉淀（包涵体）悬浮在1 mL的包涵体纯化溶液B中，室温放置5分钟。
16.12,000 rpm 4℃离心10分钟，留存上清作为SDS-PAGE的对照样品二。
17.将沉淀（包涵体）悬浮在1mL的包涵体纯化溶液B中，室温放置5分钟。
18.12,000 rpm 4℃离心10分钟，留存上清作为SDS-PAGE的对照样品三。本产品提供的包涵体纯化溶液B足够两次洗涤（两次洗涤一般可得到足够纯净的包涵体）。如果需要更多洗涤，用户需要单独购买包涵体洗涤液（溶液B）。
19.沉淀为纯化的包涵体，可以长期放置在冰箱待用或直接用于包涵体溶解。

三：包涵体的溶解：
20.在包涵体沉淀中加入250 uL包涵体溶解液，用枪头充分吹打后漩涡震荡室温放置1小时使蛋白质充分溶解。脱盐后可以进行SDS-PAGE电泳。注意：包涵体溶解液含6M盐酸胍，溶解蛋白能力强于含8M尿素的溶解液，但SDS-PAGE时不能直接上样。客户可用自备的尿素配制8-10 M 尿素的溶液（尿素溶液不稳定，所以不能长期放置）溶解包涵体，得到的溶解液可以直接用于SDS-PAGE或后续纯化。但其溶解能力弱于盐酸胍。
21.20，000g 4℃离心20分钟，小心收集上清，保留不溶性沉淀（未能溶解的包涵体）。上清脱盐后进行SDS-PAGE电泳，检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。包涵体纯化过程中引入了溶菌酶、核酸酶Benzonase等外源蛋白质，在SDS-PAGE分析时可能有额外条带出现。
22.所得蛋白质溶液可以用于复性等试验。用户可本公司购买包涵体复性套装。

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