CAT#:JW-220627-10
低温运输，-20℃保存

一管式双链cDNA合成试剂盒

产品及特点
本产品是用于一管式双链cDNA合成的试剂盒。cDNA第一链合成的原理是以Oligo dT为通用引物的、MMLV催化的逆转录反应。其原理如下：

cDNA第二链合成的原理是用RNase H使RNA-DNA杂合链中的RNA产生切口，再用E.coli DNA Polymerase I的切口平移(nick translation)活性进行RNA链取代合成cDNA第二链，其原理图如下：

本产品具有下列特点：
1.即开即用，含有合成两条cDNA链的所有试剂，用户只需要提供mRNA。
2.一管式进行，第一链cDNA合成后直接进入第二链的合成。
3.所得双链cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交等。
4.本试剂盒足够10次80uL体系的双链cDNA合成反应。
5.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用5孔盒包装
成份                                        编号                规格        包装材料
cDNA第一链合成反应液
（含Oligo-dT和dNTP）         220627a        50 uL      0.5 mL绿盖管
MMLV逆转录酶                      11-220628    10 uL       0.5 mL红盖管
5×cDNA第二链合成反应液    220627b        160 uL    0.5 mL白盖管
20×cDNA第二链
合成酶混合液                        220627c        40 uL       0.5 mL黄盖管
超纯水                                   210806         1 mL         1.5 mL蓝盖管
使用手册                               220627sc      1份            无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备物品
mRNA提取试剂盒

使用方法
一：mRNA的制备
本试剂盒不提供mRNA提取试剂，用户需自备相关试剂。

二：双链cDNA的合成
1.在一个干净的塑料离心管中，按下表设置cDNA合成反应：
成分                                                 用量
自备样品mRNA                              4 uL（0.5-2ug）
cDNA第一链合成缓冲液
（含Oligo dT引物和dNTP）           5 uL
70℃ 2分钟后室温放置2分钟，短暂离心
加入MMLV逆转录酶                       1 uL
轻柔吹打混匀后42℃保温90分钟合成第一链cDNA
超纯水                                           48 uL
5×cDNA第二链合成缓冲液           16 uL
20×cDNA第二链合成酶混合液      4 uL
共80uL。吹打混匀后，短暂离心，16℃保温2小时
2.如果需要将双链cDNA平末端化，则需加自备T4 DNA聚合酶2 uL，轻柔吹打混匀后，16℃继续保温30分钟。然后进入下一步。如果不需要将cDNA平末端化，则直接进入下一步。
3.终止反应：如果后续实验(如电泳)不担心EDTA的影响，可以直接加入4 uL 0.2M EDTA溶液终止反应，然后将样品放-20℃长期保存。如果后续实验（如PCR扩增）不担心cDNA的单双链状态，可以95℃保温10分钟终止反应。如果后续实验既受EDTA影响，又不能是单链DNA，则可以用PCR过柱纯化法纯化。
4.电泳5uL检测cDNA质量。如果cDNA在0.5-10Kb的范围内呈模糊一片，则cDNA合格。如果没看见cDNA或有其他异常，需查找原因后再继续。
5.所得cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交等实验。

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