CAT#:JW-220620
常温运输，4℃保存

细菌RNA纯化试剂盒（沉淀法）Bacterial RNA Purification Kit

产品及特点
本产品是在根据细菌特点设计的细菌总RNA提取试剂盒。它基于异硫氰酸胍/酚/氯仿提取 RNA 原理，可用于包括E.coli、Campylobacter fetus、Pseudomonas aeruginosa、Rhodobacter sphaeroides等各种常见的革氏阴性细菌。如果需要提革氏阳性细菌（如Bacillus subtilis、Staphylococcus aureus等）的RNA，可以选择本公司的真菌RNA纯化试剂盒。本产品特点如下：
1.操作简单快速，只要十分钟左右,可以全在室温下进行。
2.所得 RNA 质量高，OD260/OD280 一般在 1.9，基因 DNA 污染低。
3.灵敏度高，可以从一个菌落中提取到普通电泳能够检测到的总 RNA。
4.性价比高于进口同类产品。
5.本产品足够50次微量提取。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
成分        编号    规格    包装
细菌RNA纯化溶液    220620    100 mL    125 mL棕色瓶
使用手册        220620sc    1份    1份
本产品使用自封袋包装

运输及保存
常温运输，4℃保存，有效期一年。

自备试剂
氯仿，异丙醇，75%乙醇，RNA 溶解液

使用方法
1.在 1.5 mL 塑料离心管中离心收集 0.2-1.5 mL 新鲜细菌(注意:由于细菌 RNA半衰期十分短，所以必须使用最新鲜细菌)，吸尽液体培养基，加入1 mL 细菌 RNA纯化溶液并用枪充分吹打，确保细菌全部裂解并且没有块状物。如果使用菌落，则用接种环小心将其转移到装有1 mL细菌RNA纯化溶液的 1.5 m 塑料离心管中，用移液枪吹打均匀。在细菌数较少时，建议使用核酸助沉剂以提高RNA回收率。
2.加入0.2 mL氯仿，在振荡器上充分振荡混均30秒（必须将管底的液体振荡起来，否则不能有效将DNA打断和去除蛋白质）。
3.14,000×g室温离心3分钟。上清液无色，下层液呈篮色，中间为蛋白质。小心将上清液转移到另一干净1.5 mL塑料离心管中，上清液体积约为0.6 mL。为避免触及中间层的DNA和蛋白质，建议分小量多次吸取，并且只取0.5 mL，留0.1 mL左右不取。当细菌数量较少时，中间层将十分松散，上清时很容易吸到下层有机相，需要更加小心。
4.在上清液中加入等体积的异丙醇，振荡器上振荡混均30秒。
5.14,000×g室温离心3-10分钟，RNA将在管底侧面形成沉淀。
6.小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。
7.在离心管中加入1 mL 75%乙醇，振荡器上振荡混均30秒。
8.14,000×g室温离心1分钟。
9.小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。
10.短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液（约 50 μL）。
11.室温开盖短暂放1-2分钟后加入适量RNA-free水使RNA沉淀溶解。所得RNA溶液可以立即使用或存放于-80℃长期保存。
12.RNA完整性的电泳检测：
如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子。如果是简单检测，可以使用TAE电泳液，但文献报道必须使用变性上样液。普通DNA上样液不含变性剂，也没经过去RNase处理，所以最好不要使用。尤其需要注意的是不要使用TBE进行RNA电泳，因为TBE所含硼酸是研究多糖的经典方法----硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与RNA核糖中的羟基发生络合反应，形成RNA分子内或RNA分子间的络合复合物，使同样长度的RNA具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有大的RNA络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组DNA污染）。RNA分子内或RNA分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸与RNA的数量比例有关，而RNA样品中污染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也会参与此反应，使硼酸对RNA电泳的影响更复杂，所以TBE对RNA电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，最好是避免使用。
由于细菌细胞中70-80%的RNA为 rRNA，后者又由23S (约3700 nt)，16S (约1700 nt)和5S (约100 nt)三种组成，所以变性胶电泳后应该 在UV下看见三条清晰的rRNA带。由于核酸长度与结合 EB 的数量成 正比（当然还与RNA的二级结构有关，双链部分结合能力比单链部分强），所以23S rRNA条带的荧光强度一般比16S rRNA 条带的荧光强度强2 倍。如果这两条rRNA带不清晰或比例小于此范围则表示 RNA 有降解（因为大的 RNA 被酶降解的可能更大）。
13.RNA 产量产率测定：
将5-10 μLRNA 溶于TE缓冲液中(pH 7.5-8.2 之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA的产量和产率。注意不要将RNA稀释在 DEPC 水中检测OD260和 OD280，否则光吸收比在TE中测得的低10%-15%，因为核酸光吸收跟溶液pH相关，而DEPC水中的DEPC高压分解后产生的CO2与水反应生成碳酸，使溶液pH降低进而降低RNA的光吸收。
14.RNA纯度测定：
无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，OD260/OD230一般在2.0-2.3之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分别用DNA清除剂和 PS 清除剂去除。

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