CAT#:JW-220803-50
常温运输和保存

miRNA纯化试剂盒（过柱法）

产品及特点
本产品是用于小RNA分离纯化产品，它具有下列特点：
1.一步法直接分离纯化小RNA，比两步法（先分离总RNA和再纯化其中的小RNA）和PAGE电泳回收法更简单。得到的小RNA长度大部分在200 nt以下，包括5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、pri-miRNA、siRNA、shRNA和snRNA等。
2.柱式操作，整个过程只需要10多分钟。
3.适用范围广，可以用于动物组织、血液及部分植物组织等实验材料。
4.得到的小RNA纯度高，OD260/280一般都在1.9以上。
5.产率一般为20-40 μg/100 mg动物组织。
6.无基因组DNA的污染。
7.可用于RT-PCR、miRNA标记、microarray等后续实验。

规格及成分
成份                             编号           规格    包装材料
miRNA纯化溶液A     220803a    25 mL    30 mL棕色玻璃瓶
miRNA纯化溶液B     220803b    25 mL    30 mL本色瓶
miRNA纯化溶液C     220803c    50 mL    60 mL本色瓶
离心吸附柱               220144      50套×2    塑料袋
miRNA专用洗柱液    220803d    50 mL    60 mL本色瓶
RNA洗脱液               971207      10 mL    10 mL本色瓶
使用手册                  220803sc    1份        1份
本产品使用大盒包装

运输及保存
常温运输和保存，有效期一年。

自备试剂
氯仿。

使用方法
由于离心吸附柱的吸附量限制，本产品每次提取只能处理100 mg左右的各种组织。如果处理样品量大，请分成很多相当于微量提取的量进行，最后再收集在一起。
1.新鲜配制裂解液。将miRNA纯化溶液A和miRNA纯化溶液B按1:1的比例混合，然后根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用。注意：miRNA纯化溶液A和miRNA纯化溶液B混合后必须立即使用，不要放置，否则会产生沉淀。
a)对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10平方厘米细胞中加入1 mL新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。
b)对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106悬浮细胞中加入1 mL新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1 mL新鲜配制的裂解液的细胞使用量不要超过1×106个细胞。
c)对新鲜的动物或植物实体组织：匀浆法：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10 mL或15 mL塑料离心管中，每50-100 mg组织加1 mL新鲜配制的裂解液，用剪切式匀浆机匀浆30秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的DNA），建议组织的使用量不要超过50 mg/mL裂解液，否则十分容易产生DNA污染。液氮研磨法：将组织在液氮中研磨成粉，然后转移到新配制的裂解液中，震荡混匀。
d)对在RNA非冻型保存液中保存的动物或植物实体组织组织：先用纸吸去保存液后再剪切成小块，再按新鲜实体组织的处理方法处理。
2.将裂解物转移至一个干净的1.5 mL塑料离心管中，然后加入0.2倍体积的自备氯仿(1 mL裂解物需0.2 mL氯仿)，振荡器上充分振荡混均30秒。
3.14,000×g室温离心3-5分钟。
4.将上清液（约0.6-0.8 mL）转移到离心吸附柱中。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。为保险起见，可以留下100 μL上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。
5.14,000×g室温离心半分钟，收集管中的穿透液。大RNA及DNA将与离心吸附柱的膜结合，小RNA将存在于穿透液中。但由于离心吸附柱的最大吸附能力为40 μg动物RNA，20 μg植物RNA，所以如果样品中的大RNA含量高于上面数值，则需要减少上样量，否则穿透液中将同时含有大RNA和小RNA。
6.在最后得到的不含大RNA的穿透液中加等体积的miRNA纯化溶液C，混匀。此时溶液的总体积约1.5 mL。
7.先转移约0.75 mL到离心吸附柱中，14,000×g室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
8.将上步上柱剩余的样品转移到离心吸附柱中，14,000×g室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
9.加0.7 mL miRNA专用洗柱液到离心吸附柱中，14,000×g室温离心半分钟，弃穿透液。
10.加0.3 mL miRNA专用洗柱液到离心吸附柱中，14,000×g室温离心半分钟，弃穿透液。此步一般可以省略。
11.14,000×g室温离心半分钟以甩出残联液体。此步十分重要，否则残留的miRNA专用洗柱液会影响miRNA的使用。
12.将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free收集管中，加入50 μL RNA洗脱液，室温放置3-5分钟。
13.14,000×g室温离心半分钟，离心管中溶液即为miRNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

关联试剂
miRNA尿素-PAGE电泳套装