CAT#:JW-220735
常温运输和保存

细菌细胞膜蛋白纯化试剂盒

产品及特点
本试剂盒是基于超速离心的快速提取细菌膜蛋白的试剂盒。其原理是裂解细胞后，通过超速离心分离出细菌细胞膜和附着的蛋白质。跟传统的密度梯度离心法和去污剂法相比，本方法具有下列特点：
1.一步式分离细菌细胞膜和膜蛋白，密度梯度离心法简单快捷。
2.膜蛋白纯度高，能够去除各种胞浆蛋白的污染，也能去除松散附着在细胞膜上的蛋白，所得膜蛋白主要是整合蛋白。
3.膜蛋白完整性好。
4.回收效率高，一般能得到相当于总蛋白量6%的膜蛋白。
5.可用于Escherichia coli，Salmonella typhimurium，Klebsiella aerogens，Pseudomonas aeruginosa，Caulobacter crescentus等
细菌。
6.本产品需要冷冻超速离心机。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
成分                                             编号    规格               包装
细菌细胞膜蛋白纯化溶液A    220735a    125 mL    125 mL本色瓶
细菌细胞膜蛋白纯化溶液B    220735b    25 mL     30 mL本色瓶
细菌细胞膜蛋白纯化溶液C    220735c    250 mL    250 mL本色瓶
DNase I 干粉                         230635      3.5 mg     5 mL本色瓶
使用手册                                220735sc    1份                无
本产品采用大扁盒包装

运输及保存
常温运输和保存，但DNase I 干粉需要低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
膜蛋白溶解液(取决于后续实验。如果后续实验为SDS-PAGE，则用1×SDS-PAGE上样液作为溶解液；如果用于2D电泳，则使用1×等电点电泳上样液作为溶解液)。

使用方法
准备：第一次使用本试盒时要将所有DNase I干粉倒入B中，轻柔颠倒使DNase I干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，最好在一个月内完，否则DNase将逐渐失去活性。此外，最好在实验前1小时将细菌膜蛋白纯化细菌细胞膜蛋白纯化溶液C冰浴预冷。

用法一：小量制（用于上样量比较小的SDS-PAGE等实验）
1.收集20-40 mL过夜培养的细菌饱和培养液（OD420在1.5左右即可），2500g室温离心10分钟后弃上清。
2.加入2 mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液A，轻柔吹打，将细菌重悬于细菌细胞膜蛋白纯化溶液A中。
3.2500 g室温离心10分钟后弃上清。
4.加入0.5 mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液B（必须已经提前加入了DNase I干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有20-40 mL，细菌细胞膜蛋白纯化溶液A的用量可以等比例降低。重悬在细菌细胞膜蛋白纯化溶液A中的细菌可以放-80℃长期保存。
5.用超声或French Press方法裂解细胞，直到80%以上的细菌都裂解为止。如果用French Press方法，则需要处理至少两次，每次的压力为9.65×10E7(=14000 psi)。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程。
6.2500g室温离心8分钟后小心转移上清到新的10 mL-15 mL塑料离心管中（如BeckmanOptima台式超速离心机离心管），弃沉淀（未破裂细胞）。
7.在上清(细菌裂解液)中加入5 mL预冷的细菌细胞膜蛋白纯化溶液C，轻柔颠倒混匀后冰浴放置30-60分钟。其间可以轻柔颠倒混匀3-5次。
8.用BechmanOptima台式超速离心机在115，000 g， 4℃下离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。
9.小心移弃上清，在沉淀中加入0.2 mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液A，充分吹打混匀。
10.用BeckmanOptima台式超速离心机在115，000 g， 4℃下离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。
11.小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存，也可以直接加入0.1 mL自备的，跟后续实验兼容的缓冲液(如1×SDS-PAGE上样液中，可从本公司购买)，所得膜蛋白的浓度将在1 mg/mL左右。

用法二：大量制备（要用于上样量比较的2D电等实验）
12.收集200-400 mL过夜培养的细菌饱和培养液(OD420在1.5左右即可)，2500g室温离心10分钟后弃上清。
13.加入20 mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液A，轻柔吹打，将细菌重悬于细菌细胞膜蛋白纯化溶液A中。
14.2500 g室温离心10分钟后弃上清。
15.加入5 mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液B（必须已经提前加入了DNase I干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有200-400 mL，细菌细胞膜蛋白纯化溶液A的用量可以等比例降低。重悬在细菌细胞膜蛋白纯化溶液A中的细菌可以放-80℃长期保存。
16.用超声或French Press方法裂解细胞，直到80%以上的细菌都裂解为止。如果用French Press方法，则需要处理至少两次，每次的压力为9.65×10E7(=14000 psi)。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程。
17.2500 g室温离心8分钟后小心转移上清到干净的玻璃烧杯中，弃沉淀(未破裂细胞)。
18.在上清（细菌裂解液）中加入50 mL预冷的细菌细胞膜蛋白纯化溶液C，轻轻在冰浴中搅拌混匀30-60分钟。注：可以在大烧杯中装冰，然后将装有样品的小烧杯放入，在放入干净的搅拌子，以最低速度搅拌。
19.用Beckman Type 55.2 Ti转头在115，000 g， 4℃下离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。
20.小心移弃上清，在沉淀中加入2 mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液A，充分吹打混匀。
21.用Beckman Type 55.2 Ti转头在115，000 g， 4℃下离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。
22.小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存或溶解在1 mL自备的，跟后续实验兼容的缓冲液(如1×等电点电泳上样液，可从本公司购买)，所得膜蛋白的浓度在1 mg/mL左右。

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