CAT#:JW-220721-50
常温运输及保存

土壤DNA纯化试剂盒（过柱法）

产品及特点
本产品是专门用于从各种土壤样品和河海沉积物中提取高质量的DNA的试剂。它具有下列特点：
1.去污染效果好，得到的DNA可以直接作为PCR模板或酶切，不需要再进行去腐殖酸处理。
2.操作过程简单快速，整个操作只需要10多分钟，扩容性好。
3.产量高，每克土壤一般可以提取到5-50 ug DNA，片段长度在20-50 Kb，OD260/280一般都在1.8以上。
4.适合于各种土壤（包括河海沉积物）。
5.本产品足够50次土壤DNA微量提取，
规格及成分
成份                                                编号        规格     包装材料
土壤DNA纯化溶液A                    220721a    25 mL    30mL本色瓶
土壤DNA纯化溶液B                    220721b    25 mL    30mL本色瓶
专用上柱液                                 220721c     40 mL    60mL本色瓶
离心吸附柱                                 220144       50套      塑料袋
通用洗柱液                                 220143       50 mL    60mL本色瓶
DNA洗脱液（基因组专用）       220125       10 mL    10mL本色瓶
使用手册                                    220721sc    1份          无
本产品使用大纸盒包装

运输及保存
常温运输及保存，保存期为一年。

自备试剂
氯仿。

使用方法
1.65℃预热土壤DNA纯化溶液A，待其沉淀溶化后充分颠倒混匀。取0.5 mL加入到1.5 mL塑料离心管中并放置于65℃待用。
2.称取0.1-0.3 g的土壤，加入到装有预热的土壤DNA纯化溶液A的离心管中。
3.震荡器上剧烈震荡5-10分钟。如果是扩量操作，可以使用更多土壤和较大离心管。也可以将同一种土壤在较大离心管中震荡处理，然后再分到1.5 mL离心管中。注意:不论使用大的还是小的离心管，一定要让管底的土壤震荡起来。
4.将离心管置于65℃水浴中保温至少5分钟。
5.14000 g室温离心3分钟，将上清转移到一新离心管中(上清液一般呈淡黄色或深棕色，实际颜色取决于腐殖酸的含量，上清液的体积一般为300-400 µL)。
6.在上清液中加入等体积的土壤DNA纯化溶液B，上下颠倒30秒充分混匀，溶液将呈白色或淡黄色混浊状。
7.将离心管冰浴至少5分钟。
8.14000 g室温离心3分钟，转移上清到新的1.5 mL离心管中，上清液颜色将比第4步得到的上清的颜色稍淡，体积在0.7 mL左右。
注意：下面第8-第9步的氯仿抽提操作可以省略，直接进入第10步，但DNA的产量会低50%左右，OD260/280在1.7-1.8。如果省略第8-9步直接进入第10步，则转移的溶液体积不要超过0.6 mL，否则没有空间加专用上柱液。
9.加入0.2 mL的氯仿(自备)，震荡器上充分振荡30秒混匀。注意:一定要让管底的溶液震荡起来。
10.14000 g室温离心3分钟，小心转移上清到新离心管中。说明：离心后两相交界面将有白色膜状物，其中有机相部分颜色较深，一般呈淡棕色。上清的颜色取决于土壤中腐殖酸的含量。将上清转移到新的1.5 mL离心管时，不要超过0.6 mL，否则没有空间加专用上柱液。如果有多余的可以弃之不用。
11.加入1.5倍体积的专用上柱液，上下颠倒30秒混匀。
12.分两次上柱（即先转移一半的混合液到离心吸附柱中，14000 g室温离心半分钟，弃穿透液，然后再将剩下的混合液到离心吸附柱中，14000 g室温离心半分钟，弃穿透液）。
13.加0.7 mL通用洗柱液到离心吸附柱中，14000 g室温离心半分钟，弃穿透液。
14.再加0.3 mL通用洗柱液到离心吸附柱中，14000 g室温离心半分钟，弃穿透液。增加一步洗涤能使最后得到的DNA的纯度稍有提高。
15.14000 g室温再离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会污染DNA。
16.将离心吸附柱转移到一新的1.5 mL塑料离心管中，加入50uL DNA洗脱液（基因组DNA专用）。
17.室温放置离心吸附柱1-2分钟。
18.14000 g室温离心半分钟，离心管中溶液即为提取到的DNA样品，可以立即使用或存放于冰箱待用。

疑难解答
Q: 如何判断提取的ＤＮＡ没有腐植酸污染？
A：一是目测法，即看得到的溶液是否无色。如果呈淡棕黑色或淡黄色，说明可能是少量残留的未除尽的腐植酸。二是检测最大光吸收。注意：有腐植酸污染并不表示DNA不能使用，有的腐殖酸并不抑制PCR扩增。
Q: 腐殖酸的最大吸收波长是多少？
A：腐植酸（humic acid）是一大类呈棕黑色或黑色的物质，其结构千差万别，土壤中腐殖酸的组成和特点随土壤不同而不同，所以其最大吸收波长也各不相同，有的土壤的腐殖酸在260 nm有最大吸收（见Appl.Environ. Microbiol., 63：4993，1997），有的则在340 nm。所以用特定的波长测定OD值时波长的选定要根据土壤而决定。Sigma, Fluke等公司出售的腐植酸产品成分一般比较简单，其最大吸收波长不能推广到成分更为复杂的土壤腐殖酸样品。
Q: 是否腐植酸都会抑制后续的DNA反应？
A：否，因为腐植酸是一大类物质的统称，他们的结构和特性各不相同，所以是否对后续反应有影响最好通过实验来验证。如果用提取的DNA溶液原液进行反应而反应没发生，而对照样品（已知的不含污染的DNA）能够发生，说明可能抑制作用。
Q：如果得到的DNA样品还是含有抑制后续反应的腐植酸，如何去除？
A：如果提取的DNA原液不能扩增，可以将样品稀释10倍和100倍再进行PCR，抑制作用一般可以解除。如果仍然抑制，可以使用本公司的PCR抑制物清除剂。如果仍然不能解除，则可以通过腐殖酸清除剂（过柱法）去除。

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