CAT#:JW-220710-50
低温运输，-20℃保存

痕量DNA滚环扩增试剂盒

产品及特点
石蜡包埋切片DNA样本、血液游离DNA样本、法医DNA样本和考古DNA样本都是非常重要的实验材料，但是这些材料的DNA不但含量稀少，而且往往都高度降解，使用前都需要先进行扩增。目前进行扩增的方法很多，包括PEP-PCR、DOP-PCR、MDA、SCOMP，balanced-PCR等，但各有缺点，不尽人意。为此，本公司结合DNA环化技术和RCA滚环扩增技术，对痕量DNA进行扩增。其原理示意图如下：

本产品具有下列特点：
1.即开即用，十分简单方便，用户不需要辛苦摸索条件。
2.直接使用纯化的线状dsDNA为模板。本产品不包括纯化试剂盒。如果DNA是古旧的有损伤的DNA，需要使用另外的试剂盒（痕量古旧DNA修复及扩增试剂盒）。
3.最低可以使用5pg的模板DNA（一个人体细胞的DNA为6pg），最后可以扩增上1千-1万倍（起始模板DNA越少，扩增倍数越高）。
4.优化的反应体系，所有反应一管式完成，避免了珍贵痕量样本的丢失。
5.使用高保真的phi29 DNA聚合酶进行扩增，避免了在扩增过程中引入新突变。
6.扩增试剂含荧光染料，可以实时监测扩增反应过程，不需要跑电泳检测，节约宝贵的扩增后样品。
7.本产品足够50次20uL体系的环化-扩增反应。
8.得到的DNA可以直接用于二代测序、酶切或qPCR等后续实验。
9.本产品只能用于科研。

规格及成分
成份                                          编号               规格     包装
10×DNA环化-扩增缓冲液        220710a        100 uL    0.5mL白盖管
DNA环化酶A                            220710b         25 uL      0.5mL红盖管
DNA环化酶B                            220710c         25 uL      0.5mL红盖管
RCA专用随机引物溶解液         220710d        100 uL    0.5mL绿盖管
RCA专用随机引物干粉             230511          50次       0.5mL本色管
phi29 DNA聚合酶，10U/uL    11-221198        50 uL    0.5mL红盖管
超纯水                                          1mL           1mL       1.5mL蓝盖管
使用手册                                221080sc         1份         无
本产品使用十孔盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存,有效期为一年。

自备试剂
样本DNA纯化试剂盒、DNA片段回收试剂盒（从RCA反应体系中回收扩增产物）

使用方法
一、DNA环化
1.首次使用本试剂盒时，需要在RCA专用随机引物溶解液化冻后，将110uL全部加入到RCA专用随机引物干粉管中，涡旋震荡半分钟溶解，短暂离心，得RCA专用随机引物。放冰上待用。没用完的需要放-20℃长期保存。
2.按下表在200uL的PCR管中设置和进行DNA环化-扩增反应：
成分                                            管1（样本）    管2（无模板对照）
自备模板DNA（5pg-100ng）    1-8.5 uL             不加
10×DNA环化-扩增缓冲液            1 uL                  1 uL
超纯水                                        加到9.5 uL        加到9.5 uL
DNA环化酶A                               0.5 uL               0.5 uL
合计                                             10 uL               10 uL
在PCR仪器上37℃ 2小时，65℃ 20分钟灭活酶
超纯水                                        4.0 uL             4.0 uL
10×DNA环化-扩增缓冲液          0.5 uL              0.5 uL
DNA环化酶B                             0.5 uL              0.5 uL
合计                                           15 uL              15 uL
室温放置2小时，65℃ 10分钟灭活酶
超纯水                                    1.5 uL        1.5 uL
10×DNA环化-扩增缓冲液       0.5 uL        0.5 uL
RCA专用随机引物溶液              2 uL         2 uL
合计                                         19 uL        19 uL
放在PCR仪器上，设置95℃加热5小时，自然冷却到室温。
再加入下列成分
phi29 DNA聚合酶，10U/uL    1 uL        1 uL
混匀后放荧光定量PCR仪器上，设置30℃保温16小时，每10分钟设置成一个循环，每个循环采集一次SYBR通道的荧光信号。

二、数据分析
3.由于是可以实时检测RCA扩增反应，所以RCA扩增反应不一定进行16小时，可以在扩增荧光信号的曲线进入平台期（已经没有新的DNA合成）后结束。因为phi29 DNA聚合酶有很强的3-5外切酶活性，在扩增反应耗尽dNTP后，它可能会进入酶切模式，逐渐降解已经合成的DNA。
4.65℃保温10分钟灭活酶。由于phi29 DNA聚合酶有很强的3-5外切酶活性，因此必须灭活，否则它将逐渐降解反应管中已经合成的DNA。
5.典型实验结果。有扩增的样本将有平缓的S荧光曲线，无模板对照将没有此扩增曲线（见下图）：

6.如果没有荧光定量PCR仪器，则只能电泳检测或PCR检测是否有扩增。
7.扩增所得DNA可以用于后续实验，如qPCR扩增。如果后续实验需要纯化去除dNTP（如通过测OD确定浓度）或去除RCA专用随机引物，则需要自备试剂盒进行纯化处理。

关联产品
痕量古旧DNA修复及扩增试剂盒