CAT#:JW-220898-20
低温运输，-20℃保存

SP6 RNA转录标记试剂盒（生物素标记）

产品及特点
本试剂盒是基于SP6 RNA聚合酶体外转录原理的标记试剂盒，它利用含有SP6启动子的模版DNA，以含biotin标记的UTP和NTP为底物，从SP6启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的、biotin标记的RNA探针。本标记反应的示意图如下：

本产品具有下列特点：
1.即开即用，用户只需提供含SP6启动子的DNA模板即可以进行体外转录标记实验，不需要单独准备每一个成份。
2.单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3.模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4.可以合成的biotin标记的RNA的最佳长度在20nt到2000 nt之间。
5.产品配方经过精心优化，每mg DNA模版可以合成2 mg biotin标记的RNA。
6.得到的biotin标记的RNA探针可以用于分子杂交等实验。
7.本试剂盒足够20次20 mL体系的体外转录实验。
8.本产品只能用于科研。
规格及成分
成份                                               编号        规格                包装
2×SP6转录标记预配液
(含NTP和biotin-UTP)                    220898a    0.2 mL    0.5 mL绿盖管
SP6 RNA聚合酶-RI混合液          220898b      20 mL    0.5 mL红盖管
RNase-free水                                980403    1 mL       1.5 mL蓝盖管
使用手册                                    220898sc    1份                无
本产品采用五孔盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存、有效期一年。

自备试剂
Tris饱和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇、RNase-free 的塑料离心管、EDTA溶液(均可从本公司另购)、单链RNA定量试剂盒。

使用方法
一、制备DNA模板（本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考）
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录标记的模板，但是必须注意以下几点。
一是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
二是需要转录的DNA序列的上游必须有SP6启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将SP6启动子序列（5’ATT TAG GTG ACA CTA TAG 3’）加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有SP6启动子的载体，并且克隆位点必须位于SP6启动子下游。
三是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3’突出。如果是3’突出（比如选择了Pst I来线性化质粒），则最好用T4 DNA聚合酶修平。
四是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收的方法回收质粒DNA，并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。如果有RNase污染，则必须使用酚-氯仿抽提法反复去除残留的RNase，然后再乙醇沉淀质粒DNA。
二、体外转录标记反应
1.如果有N个样品，强烈建议做一个阴性对照，故共设置N+1个反应，这样一起并排电泳时容易判断哪个条带是模板DNA，哪个条带是扩增得到的标记RNA。在N+1个RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在4℃下）按次序加入下列成分（SP6转录标记预配液容易产生结晶沉淀，一定要握在手中直到结晶彻底溶解并摇匀后方可使用）：
成分                                   N个样品管                                         阴性对照管
DNA模板            50 ng左右的PCR片段或1 mg左右的线状质粒     不加
2×SP6转录标记预配液
(含NTP和biotin-UTP)             各10 mL                                            10 mL
SP6 RNA聚合酶-RI混合液     各1 mL                                               1 mL
补RNase-free水到                   20 mL                                               20 mL
注：此为20mL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。本产品的SP6转录标记预配液已经含有NTP和biotin-UTP。
2.37℃保温1-2小时，再42℃保温1-2小时。
3.加入2mL自备的500mM的EDTA溶液灭活SP6 RNA聚合酶。
4.取1-3 mL电泳。电泳时比阴性对照多出的条带就是扩增得到的标记RNA（由于合成的标记RNA长度不均匀，即使长度均匀，但由于自生形成发夹结构，泳动速度也不一致，所以电泳所得标记RNA条带一般都不是清晰，而是比较弥散的电泳条带。但由于标记RNA是单链，分子量比同样长度的DNA小一倍，因此标记RNA一般比其双链DNA模板电泳速度更快。
5.定量，可以用自备的单链RNA定量试剂盒检测浓度。不推荐使用电泳定量。使用本试剂盒时1mg DNA模板一般可以合成 2mg的标记RNA。
6.得到的标记RNA可以放-80℃保存也可以直接用于分子杂交。杂交时双链的模板DNA并不会干扰杂交，故可以不去除。

关联产品
SP6 RNA转录标记试剂盒（地高辛DIG标记）