货号：JWSH1110                                                    规格：50管/48样
硫氧还蛋白氧化还原酶（thioredoxin reductase, TrxR）活性测定试剂盒说明书
可见分光光度法

产品说明：
TrxR 是一种NADPH 依赖的包含FAD 结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与GR 活性类似，催化GSSG 还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。
TrxR 催化NADPH 还原DTNB 生成TNB 和NADP+，TNB 在412 nm 有特征吸收峰，通过测定412nm 波长处TNB 的增加速率，即可计算TrxR 活性。

自备仪器和用品：
可见分分光光度计、低温离心机、可调节移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

产品内容：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入5 mL 蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入5 mL 蒸馏水溶解。

操作步骤：
一、粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待检测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3 s，间隔7s，总时间3min），然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

二、TrxR 测定操作：
1.分分光光度计预热30 min 后，调节波长到412nm，用蒸馏水调零。
2.试剂一在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热30min。
3.空白管：取1mL 玻璃比色皿，加入100μL 试剂二，100μL 试剂三，800μL 试剂一，迅速混匀后于412 nm 测定10 s 和310 s 吸光度，记为A1 和A2。△A 空白管=A2-A1。
4.测定管：取1mL 玻璃比色皿，加入100μL 试剂二，100μL 试剂三，700μL 试剂一，100μL上清液，迅速混匀后于412 nm 测定10 s 和310 s 吸光度，记为A3 和A4。△A 测定管=A4-A3。

三、TrxR 活性计算：
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmol DTNB 还原。
TrxR（U/mg prot）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T
= 0.147×（△A 测定管-△A 空白管）÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每克样本每分钟催化1μmol DTNB 还原。
TrxR（U/g）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 0.147×（△A 测定管-△A 空白管）÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每104 个细胞每分钟催化1μmol DTNB 还原。
TrxR（U/104 cell）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V样总)÷T
= 0.147×（△A 测定管-△A 空白管）÷细胞数量
ε：TNB 在412nm 处的微摩尔消光系数，0.0136 L/μ mol/cm；d：比色皿管光径，1cm；V 反总：反应体系总体积（L），1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），100μL=0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间（min），5 min.

注意事项：
1.测定前须称取1～2 个样做预实验，使得吸光值在5min 内程线性变化。
2.哺乳动物组织及血液制品TrxR 活力测定时，一般须用蒸馏水稀释5 倍左右。测定过程操作须迅速。