货号：JW1200                                                  规格：50 管/48 样
ATP 含量试剂盒说明书
HPLC 法
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：
    ATP 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定 ATP 含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。
测定原理：
ATP 在 254 nm 下有吸收峰，可以利用高效液相色谱法测定其含量。

需自备的仪器和用品：
    高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50 个，0.22μm）、滤 膜（水系和有机系各 1 个，0.45μm）、C18 柱（4.6 ×150 mm）、可调式移液器、样品瓶（50 个，2mL）、甲醇（色谱级，300 mL）和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：自备,取2ml浓高氯酸，加入58ml双蒸水，4℃保存。；
试剂二：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂 1×1 瓶，粉剂 2×1 瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1和粉剂2 溶解 后倒入 1000mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 1000mL，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶 中的粉剂要冲洗干净）, 4℃可保存 1 周；
试剂四：ATP 标准品 5mg×1 支，-20℃保存；

实验前的准备工作：
1、将蒸馏水 1000 mL、流动相缓冲液基质 1000 mL 和甲醇 300 mL 用 0.45 μm 的滤膜抽滤， 以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：蒸馏水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，甲醇 用有机系滤膜抽滤）。
2、流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质 1000 mL 与甲醇配比为 99.9：0.1（v/v）， 即取 999mL 缓冲液基质与 1mL 甲醇混合。
3、将抽滤完毕的甲醇和蒸馏水配比成 100%的甲醇， 10%的甲醇，蒸馏水各250 mL。 将2和 3中的溶剂超声 20 分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。

ATP 的提取：
1、组织的处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一），进行冰浴匀浆，4000g 常温离心 15 min，取上清液，加入等体积 的试剂二，混匀，4000 g 常温离心 15 min，取上清，针头式过滤器过滤后待测。
2、细胞或细菌的处理：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数 量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；4000 g 常温离心 15 min，取上清液，加入等体积的试剂二，混匀，4000 g 常温离心 15 min，取上清，针头式过滤器过滤后待测。

标准品的配制：
在试剂四中加入 1mL 蒸馏水，配成 5mg/mL 母液，将母液用蒸馏水分别稀释成 100 μg/mL、 80μg/mL、6 0μg /mL、40 μg /mL 和 20 μg /mL 的 ATP 标准品溶液。针头式过滤器过滤后待 测。
 ATP 含量测定操作步骤：
1. 开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量 20 μL，流速 1 mL/min，保留时间 10min，检测波长 254nm，设置完毕保存方法组。
2. 用 100%的甲醇、10%的甲醇、蒸馏水按甲醇浓度从大到小的顺序过色谱柱 30min。
3. 用流动相过柱子，待基线稳定后开始加样。
4. 加入标准品 20 μL，在 10min 内可分离 ATP， ATP 的保留时间在 3min 左右，（柱子不同， 保留时间有差异），计算不同浓度的 ATP 标准品的峰面积。
5. 加入样品 20 μL，在相应保留时间处检测 ATP 的峰面积。
ATP 含量的计算：
以标准品浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标计算 ATP 标准曲线。将样品峰面积代入 标准曲线，计算样品 ATP 含量。

注意事项：
1、为了避免使用过程中柱压过大，流速由小到大调节。
2、 使用完毕时，由于流动相含有缓冲盐，用水冲洗柱子 1 小时，以防止缓冲盐结晶堵塞色 谱柱，然后用 10%的甲醇、100%的甲醇按甲醇浓度从小到大的顺序洗色谱柱 30min。
3、标准品的稀释倍数要根据样品中 ATP 浓度确定，样品中 ATP 的峰面积必须落在不同浓 度的 ATP 标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。