动物细胞/组织细胞核高纯超离分离试剂盒产品说明书

主要用途
动物细胞/组织细胞核高纯超离分离试剂是一种旨在从动物细胞或组织中分离出活性完整而高度纯化的细胞核细胞器的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于动物组织和培养细胞的活性细胞核的制备。其制备物产量高，活性保证，纯度可达99％。可以被用于后续EMSA、体外转录反应、核转录终止（run-off）实验、转录图谱分析（profiling）、体外核凋亡检测、以及核染色质、基因组DNA、核RNA/RNP、组蛋白的纯化等实验。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度俱佳。

技术背景
细胞核是细胞中最大的细胞器，细胞核的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。细胞核结构和功能的研究，包括细胞核的系列活动、染色质结构、基因表达的转录调节、RNA合成和操作、核双向转运的调节机制、核凋亡等。从任何组织或细胞分离细胞核的技术方法基本上采用：第一，通过机械或温和低渗化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心获得粗提细胞核；第三，通过等密度离心获得高纯度的细胞核，去除所有细胞浆成分，例如微粒体、线粒体、神经髓鞘成分，尤其是与核膜相连的粗面内质网。

产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
裂解液（Reagent B）        毫升
活性液（Reagent C）        微升
强化液（Reagent D）    微升
高纯液（Reagent E）        毫升
保存液（Reagent F）        毫升
产品说明书        1份

保存方式
保存裂解液（Reagent B）、活性液（Reagent C）、高纯液（Reagent E）和保存液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；裂解液（Reagent B）、高纯液（Reagent E）和保存液（Reagent ）严格无菌操作；有效保证6月

用户自备
HANK平衡盐缓冲溶液（G&VS12028）或PBS缓冲溶液（G&VS12033）：用于清理细胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（G&VS12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（G&VS12052）：用于中和胰蛋白酶的细胞培养基
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
4℃台式离心机：用于样品操作
4℃超速离心机：用于样品操作
DOUNCE匀浆器：用于裂解组织和细胞

实验步骤
一、动物组织细胞核分离
实验开始前，将试剂盒里的裂解液（Reagent B）和活性液（Reagent C）冻融，然后移取xx微升活性液（Reagent C）、 xx微升强化液（Reagent D）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1．手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量
2．（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入适量的（1克组织需要xx毫升）清理液（Reagent A）清洗1次
4．即刻用刀片切碎组织
5．放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6．加入预冷的xx毫升裂解工作液
7．涡旋震荡5秒，充分混匀
8．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
9．在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项6）
10．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
11．加入xx毫升预冷的高纯液（Reagent E），上下倾倒混匀（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent E)）
12．同时移取xx毫升预冷的的高纯液（Reagent E）到20毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent E)）
13．轻轻加入上述14毫升匀浆混匀液在高纯液（Reagent E）的上面，避免震动
14．放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为30000g
15．小心取出超速离心管：可见管底薄薄乳黄色样品颗粒——此步骤获得高纯细胞核样品
16．小心抽去细胞核样品颗粒以上的液体
17．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A）
18．置于冰槽里孵育20分钟
19．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为500g
20．小心抽去上清液
21．加入xx微升预冷的保存液（Reagent F），混匀
22．即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
23．放进－70℃冰箱里保存
 
二、动物细胞细胞核分离
实验开始前，将试剂盒里的裂解液（Reagent B）和活性液（Reagent C）冻融，然后移取xx微升活性液（Reagent C）、 xx微升强化液（Reagent D）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1．准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
2．分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
3．重复实验步骤2一次
4．加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面
5．置入37℃培养箱3分种
6．轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
7．分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液
8．移入一个50毫升锥形离心管
9．放入台式离心机离心10分钟，速度为200g
10．小心抽去上清液
11．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞
12．放入台式离心机离心10分钟，速度为300g
13．小心抽去上清液
14．加入预冷的xx毫升裂解工作液
15．涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
16．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
17．在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约40下）（注意：参见注意事项6）
18．将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
19．加入xx毫升预冷的高纯液（Reagent E），上下倾倒混匀（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent E)）
20．同时移取xx毫升预冷的高纯液（Reagent E）到20毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent E)）
21．轻轻加入上述14毫升匀浆混匀液在高纯液（Reagent E）的上面，避免震动
22．放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为30000g
23．小心取出超速离心管：可见管底薄薄乳黄色样品颗粒——此步骤获得高纯细胞核样品
24．小心抽去细胞核样品颗粒以上的液体
25．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A）
26．置于冰槽里孵育20分钟
27．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为500g
28．小心抽去上清液
29．加入xx微升预冷的保存液（Reagent F），混匀
30．即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
31．放进－70℃冰箱里保存

注意事项
1．本产品为10次操作（1克动物组织或5 X 107细胞）
2．所有操作均须在4℃或以下状态进行
3．操作时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）、高纯液（Reagent E）和保存液（Reagent F）
4．建议使用足够的组织或细胞量
5．建议严格控制操作时间
6．通常匀化次数为40至80下（或细胞颗粒群/组织块状消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
7．建议使用30000g以上离心速度；如果没有条件，则不能低于20000g，离心时间增加为60至90分钟
8．通常1克动物组织或5 X 107细胞的细胞核得率为50%以上（细胞核计数）
9．如果需要计量细胞核，建议使用纯化细胞核台酚蓝染色试剂盒——G&VS10448
10．本产品所获得的细胞核纯度（可达到99％）和产量最为理想
11．使用高纯液（Reagent E）前，须摇匀后加入；并注意避免污染母液
12．根据超速离心管的大小调整高纯液（Reagent E）的使用量
13．本公司提供系列细胞核分析试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定分离的细胞核完整
3．本产品经鉴定分离的细胞核维持正常活性
4．本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶
5．本产品经鉴定分离的细胞核纯度达99％

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                规格        
G&VS10100.3    动物细胞/组织细胞核高纯超离分离试剂盒    10次
G&VS10100.3A    清理液（Reagent A）            毫升
G&VS10100.3B    裂解液（Reagent B）            毫升
G&VS10100.3C    活性液（Reagent C）            毫升
G&VS10100.3D    强化液（Reagent D）        毫升
G&VS10100.3E    高纯液（Reagent E）            毫升
G&VS10100.3F    保存液（Reagent F）            毫升
G&VS12024    胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液        毫升
G&VS12028    HANKS 平衡盐缓冲溶液        毫升
G&VS12033    PBS缓冲溶液            毫升
G&VS12052    DMEM完全细胞培养基        毫升    

试剂盒订购信息    
产品编号        名称                规格
G&VS10100.1    动物细胞/组织细胞核粗提分离试剂盒    10/50次
G&VS10100.2    动物细胞/组织活性细胞核分离试剂盒    10/50次
G&VS10100.3    动物细胞/组织细胞核高纯超离分离试剂盒    10次
G&VS10100.4    动物细胞/组织细胞核高纯分离试剂盒    10次
G&VS10448    纯化细胞核台酚蓝染色试剂盒        20次