动物全血线粒体粗提分离试剂盒产品说明书

主要用途
动物全血线粒体粗提分离试剂是一种旨在通过化学溶解以纯化血白细胞、物理或化学破膜及离心处理分离出完整而纯化的线粒体细胞器的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物血细胞中的线粒体的制备。其制备物产量高，可以被用于细胞凋亡、信号传递、能量代谢、蛋白组学和病理生理学等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度优异。

技术背景
线粒体细胞器的研究是现代细胞生物学的最重要的课题之一。线粒体成为生物衰老、古生物、细胞凋亡、肿瘤、HIV、老年痴呆症、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要对象。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：第一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。

产品内容
血溶液（Reagent A）        毫升
清理液（Reagent B）        毫升
裂解液（Reagent C）        毫升
净化液（Reagent D）        毫升
强化液（Reagent E）        毫升
保存液（Reagent F）        毫升
产品说明书                          1份

保存方式
保存净化液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
涡旋震荡仪：用于混匀
4℃（微型）台式离心机：用于样品操作
4℃超速离心机：用于样品操作
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
 
实验步骤
一、白细胞分离
实验开始前，室温预热的血溶液（Reagent A），同时4℃预冷清理液（Reagent B）。然后进行下列操作。
1．准备2个无菌的50毫升锥形离心管
2．轻轻混匀新鲜的EDTA等抗凝的全血样品
3．分别移出5毫升全血样品到每个50毫升锥形离心管
4．分别加入xx毫升室温预热的血溶液（Reagent A）
5．轻轻上下倾倒离心管5次，确保充分混匀
6．室温下（25℃）孵育4分钟，期间轻轻上下倾倒离心管数次（注意：血液颜色可能由不透明红色到清澈红色的变化）
7．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽掉上清液，留下500微升液体，以防抽掉白细胞颗粒群
9．用手指轻弹离心管2至3下，使白细胞颗粒群松动
10．分别加入xx毫升预冷的清理液（Reagent B），混匀细胞
11．2管50毫升锥形离心管合并为1管
12．放入台式离心机离心10分钟，速度为300g
13．小心抽去上清液
14．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent B），混匀细胞
15．放入台式离心机离心10分钟，速度为300g
16．小心抽去上清液，确保没有液体残留（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）

二、白细胞线粒体分离
实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent D）冻融，然后移出xx毫升净化液（Reagent D）到xx毫升的裂解液（Reagent C）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作，根据用户要求选择其中一种方法：
方法一：细胞匀浆法
1．加入预冷的xx毫升裂解工作液
2．涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
3．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
4．在冰槽里用匀浆帮匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项12）
5．将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
6．放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
7．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
8．放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
9．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
10．（选择步骤）加入xx毫升预冷的保存液（Reagent F）
11．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
12．（选择步骤）小心抽去上清液
13．加入xx微升至xx毫升保存液（Reagent F），充分混匀
14．即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

方法二、化学处理法
1．加入预冷的xx毫升裂解工作液
2．涡旋震荡5秒，充分混匀
3．在冰槽里孵育2分钟，其中每间隔一分钟涡旋震荡5秒
4．加入预冷的xx微升强化液（Reagent E）
5．涡旋震荡5秒，充分混匀
6．在冰槽里孵育5分钟，其中每间隔一分钟涡旋震荡5秒（注意：参见注意事项13）
7．加入预冷的xx毫升保存液（Reagent F），用手指轻弹混匀
8．放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
9．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
10．放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
11．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
12．（选择步骤）加入xx毫升预冷的保存液（Reagent F）
13．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
14．（选择步骤）小心抽去上清液
15．加入xx微升至xx毫升保存液（Reagent F），充分混匀
16．即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

注意事项
1．本产品为10次（10毫升全血/次）操作
2．所有操作均须无菌状态下进行
3．线粒体操作均须在4℃或以下状态下进行
4．操作时，须戴手套
5．操作时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
6．建议使用足够的样品量
7．建议严格控制操作时间
8．建议使用新鲜全血
9．建议全血样品和血溶液（Reagent A）充分混匀，否则造成血红细胞的不完全溶解
10．建议全血样品和血溶液（Reagent A）孵育时间5分钟为佳，以防白细胞损害
11．每毫升全血平均可获得2.5 X 106白细胞
12．通常匀化次数为20至40下（或细胞颗粒群消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
13．通常孵育5分钟（不宜超过5分钟）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
14．通常1 X 107血白细胞的线粒体含量最低为50微克线粒体蛋白
15．如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解
16．本产品所获得的线粒体纯度和产量最为理想。通过调整10000g离心速度到3000至8000g，可以提高粗提的线粒体纯化程度，但线粒体产量相应减少
17．如果需要获得99％以上纯度的线粒体，使用动物全血高质纯化线粒体分离试剂盒－G&VS10099.3
18．线粒体正常活性测定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等
19．线粒体内外膜完整测定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和荧光JC染色
20．本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等
21．本公司提供系列线粒体试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定分离的线粒体内外膜完整
3．本产品经鉴定分离的线粒体维持正常活性
4．本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                规格        
G&VS10099.1    动物全血线粒体粗提分离试剂盒        10/20次
G&VS10099.1A    血溶液（Reagent A）            毫升
G&VS10099.1B    清理液（Reagent B）            毫升
G&VS10099.1C    裂解液（Reagent C）            毫升
G&VS10099.1D    净化液（Reagent D）        毫升
G&VS10099.1E    强化液（Reagent E）            毫升
G&VS10099.1F    保存液（Reagent F）            毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称    规格
G&VS10006.1    动物细胞/组织线粒体粗提分离试剂盒    10/50次
G&VS10006.2    动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒    10/50次
G&VS10006.3    动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10006.4.1    动物硬组织线粒体粗提分离试剂盒    50次
G&VS10006.4.2    动物硬组织活性线粒体分离试剂盒    50次
G&VS10006.4.3    动物硬组织高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10018    纯化线粒体溶解试剂盒        20次
G&VS10047    非突触体脑组织线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10048.1    植物线粒体粗提分离试剂盒        10次
G&VS10048.2    植物活性线粒体分离试剂盒        10次
G&VS10048.3    植物高质纯化线粒体分离试剂盒        10次
G&VS10049.1    真菌/酵母细胞线粒体粗提分离试剂盒    10次
G&VS10049.2    真菌/酵母细胞活性线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10049.3    真菌/酵母细胞高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10059    纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂盒    20次
G&VS10062.1    动物血小板线粒体粗提分离试剂盒    10次
G&VS10062.2    动物血小板活性线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10062.3    动物血小板高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10099.1    动物全血线粒体粗提分离试剂盒        10次
G&VS10099.2    动物全血活性线粒体分离试剂盒        10次
G&VS10099.3    动物全血高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS30034.1    纯化线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.2    细胞/组织线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.3    真菌/酵母细胞线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.4    植物线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.5    全血线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.6    动物血小板线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS10063.1    海洋动物（虾贝类）线粒体粗提分离试剂盒    10/50次
G&VS10063.2    海洋动物（虾贝类）活性线粒体分离试剂盒    10/50次
G&VS10063.3    海洋动物（虾贝类）高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS12198    纯化线粒体冻存液            50毫升