HOECHST 33342和PROPIDIUM IODIDE细胞膜变检测试剂盒产品说明书

主要用途
 HOECHST 33342和PROPIDIUM IODIDE细胞膜变检测试剂是一种旨在通过荧光染料的细胞膜差异通透性（differential permeability）呈现的DNA结合性荧光，来分析细胞膜损伤与否，进而定性或定量区别活细胞、死细胞（坏死细胞）和凋亡细胞状况的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞类型（动物、人体、植物、昆虫等）的观察。产品严格无菌，即到即用，荧光清晰，操作简捷，性能稳定。

技术背景
赫斯特染料（Hoechst 33342）为特异性 DNA 活性染料，与 A-T 键结合，其激发波长是350nm，散发波长是460nm，呈现蓝色荧光；而碘化丙啶（Propidium iodide；PI）为DNA碱基嵌入剂，没有碱基结合优先性，其激发波长是488nm，散发波长是630nm，呈现红色荧光。根据荧光染料的膜通透性特征：第一，定性确定细胞膜的损伤状况；第二，定性或定量区别正常活细胞、死细胞（坏死细胞）、凋亡细胞等。正常活细胞，其胞膜完整，拒绝两种染料进入胞内；死细胞，其胞膜完全破损，可以呈现两种荧光；凋亡细胞，选择性拒绝碘化丙啶进入，允许赫斯特染料进入，且荧光强度高于正常活细胞。

产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
补充液（Reagent B）        毫升
染色液A（Reagent C）    微升
染色液B（Reagent D）    微升
产品说明书        1份

保存方式
保存染色液A（Reagent C）和染色液B（Reagent D）在－20℃冰箱里，用铝箔封裹，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（G&VS12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（G&VS12052）：用于中和胰蛋白酶的处理
15毫升锥形离心管：用于细胞收集的容器
1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器
（微型）台式离心机：用于细胞收集的操作
荧光显微镜：用于观察细胞荧光染色
细胞流式仪：用于细胞荧光分析

实验步骤
实验开始前，从－20℃冰箱里取出染色液A（Reagent C）和染色液B（Reagent D），置入冰槽里融化，避免光照。移出xx微升补充液（Reagent B）和xx微升染色液A（Reagent C）到新的1.5毫升离心管，混匀后标记为染色工作液A。再次移出xx微升补充液（Reagent B）和xx微升染色液B（Reagent D）到新的1.5毫升离心管，混匀后标记为染色工作液B。然后进行下列操作：

一、直接法
1．准备1个细胞培养12孔板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约30万细胞数）
2．小心抽去细胞培养液
3．轻轻沿着孔壁加入xx毫升 清理液（Reagent A）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面
4．小心抽去xx毫升 清理液（Reagent A）
5．小心加入xx微升含有补充液（Reagent B）和染色液A（Reagent C）的染色工作液A， 覆盖培养孔表面
6．放进37℃培养箱孵育10分钟，避免光照
7．小心抽去染色液
8．即刻置于冰槽里
9．小心加入xx微升含有补充液（Reagent B）和染色液B（Reagent D）的染色工作液B， 覆盖培养孔表面
10．在冰槽里孵育10分钟
11．轻轻沿着孔壁加入xx毫升 清理液（Reagent A）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面
12．小心抽去xx毫升 清理液（Reagent A）
13．即刻在倒置荧光显微镜下进行观察：同一视野，先使用光学显微镜观察细胞位置，然后使用紫外荧光观察蓝色细胞，最后使用红色荧光，观察红色细胞。按照下表进行分析：
 
        染色液A（Reagent C）    染色液B（Reagent D）
荧光染料        HOECHST 33342        PROPIDIUM IODIDE
荧光参数        激发：350nm；散发：460nm    激发：488nm；散发：630nm
荧光颜色        蓝色            红色
正常活细胞    无荧光或低蓝色荧光        无荧光
死亡（坏死）细胞    强烈蓝色荧光        强烈红色荧光
凋亡细胞        强烈蓝色荧光        无荧光
膜完整        无荧光            无荧光
轻度膜损伤变化    蓝色荧光            无荧光
中度膜损伤变化    强烈蓝色荧光        红色荧光
重度膜损伤变化    强烈蓝色荧光        强烈红色荧光

二、间接法
1．准备1个细胞培养12孔板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约30万细胞数）
2．小心移出细胞培养液到15毫升锥形离心管（收集悬浮细胞）
3．加入xx毫升 清理液（Reagent A）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面
4．小心移出xx毫升 清理液（Reagent A）到15毫升锥形离心管（收集洗脱细胞）
5．加入500微升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养孔表面
6．放进37℃培养箱孵育1分种
7．轻轻手击震动培养板，使细胞脱落
8．加入1毫升用户自备的完全细胞培养液
9．移入到15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
10．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
11．小心抽去上清液
12．加入xx毫升清理液（Reagent A）
13．用200微升枪头上下轻柔抽吸，混匀细胞颗粒群
14．移入到1.5毫升离心管
15．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
16．小心抽去上清液
17．加入xx微升含有补充液（Reagent B）和染色液A（Reagent C）的染色工作液A，混匀
18．放进37℃培养箱孵育10分钟，避免光照
19．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
20．小心抽去上清液
21．加入xx微升含有补充液（Reagent B）和染色液B（Reagent D）的染色工作液B，混匀
22．在冰槽里孵育10分钟，避免光照
23．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
24．小心抽去上清液
25．加入xx微升清理液（Reagent A），混匀
26．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
27．小心抽去上清液
28．加入xx微升清理液（Reagent A），混匀
29．即刻移取50微升在载玻片上压片
30．在荧光显微镜下进行观察：同一视野，先使用光学显微镜观察细胞位置，然后使用紫外荧光观察蓝色细胞，最后使用红色荧光，观察红色细胞。按照下表进行分析：
 
        染色液A（Reagent C）    染色液B（Reagent D）
荧光染料        HOECHST 33342        PROPIDIUM IODIDE
荧光参数        激发：350nm；散发：460nm    激发：488nm；散发：630nm
荧光颜色        蓝色            红色
正常活细胞    无荧光或低蓝色荧光        无荧光
死亡（坏死）细胞    强烈蓝色荧光        强烈红色荧光
凋亡细胞        强烈蓝色荧光        无荧光
膜完整        无荧光            无荧光
轻度膜损伤变化    蓝色荧光            无荧光
中度膜损伤变化    强烈蓝色荧光        红色荧光
重度膜损伤变化    强烈蓝色荧光        强烈红色荧光

31．或转入到细胞流式仪专用测试管，即刻进行细胞流式仪分析：观察50000个细胞以上
32．建立地形图或散点图以及直方图分析

        染色液A（Reagent C）    染色液B（Reagent D）
荧光染料        HOECHST 33342        PROPIDIUM IODIDE
荧光颜色        蓝色            红色
激发波长        350            488（使用phycoerythrin的信号检测）
流式仪通道    FL1            FL2
正常活细胞    低荧光；左下象限        低荧光；左下象限
死亡（坏死）细胞    高荧光；右上象限（也可左上象限）    高荧光；右上象限（也可左上象限）
凋亡细胞        高荧光；右下象限        低荧光；右下象限

注意事项
1．本产品为50次（8个12孔细胞培养板）操作
2．所有操作均须无菌状态下进行
3．确保实验准确性，须收集所有悬浮和贴壁细胞；同时要确保足够的细胞数
4．可用35mm培养皿、6孔培养板或25cm2细胞培养瓶操作，相应增加染色液的用量。但12孔培养板为理想选择
5．操作时，须戴手套
6．孵育时，须避免光照
7．建议细胞染色完成后，即刻进行分析
8．细胞流式仪分析前，须混匀内容物
9．细胞流式仪分析，细胞检测量不得少于10000个
10．细胞类型不同，对于染色的反应会不同
11．告知流式仪技术员有关细胞类型
12．本公司提供系列细胞凋亡试剂产品

质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定荧光清晰

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                    规格        
G&VS10092.1     HOECHST 33342和PROPIDIUM IODIDE细胞膜变检测试剂盒    50次    
G&VS10092.1A    清理液（Reagent A）                毫升
G&VS10092.1B    补充液（Reagent B）                毫升
G&VS10092.1C     染色液A（Reagent C）            毫升
G&VS10092.1D     染色液B（Reagent D）            毫升
G&VS12024    胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液            毫升
G&VS12052     DMEM完全细胞培养基            毫升    

试剂盒订购信息
产品编号        名称                        规格
G&VS10092.1    HOECHST 33342和PROPIDIUM IODIDE细胞膜变检测试剂盒    50次
G&VS10092.2    吖啶橙（acridine orange）和溴化乙锭（ethidium bromide）双染细胞凋亡检测试剂盒    50次
G&VS10092.3     吖啶橙（Acridine Orange）/赫斯特33342（HOECHST33342）双染细胞凋亡检测试剂盒    50次
G&VS10092.4     吖啶橙（Acridine Orange）/碘化丙啶（PROPIDIUM IODIDE）双染细胞凋亡检测试剂盒    50次