CAT#:JW-220520
常温运输及保存

动物线粒体DNA纯化试剂盒（过柱法，PCR级）

产品及特点
动物线粒体DNA（mtDNA）是进行分子进化研究和母性遗传研究的重要材料，但传统的两步式动物mtDNA提取方法需要先温和裂解动物细胞，分离线粒体，然后再从线粒体中提取mtDNA。此方法中的温和裂解细胞的条件十分难以控制，需要针对不同组织材料单独进行优化，因此纯化效果差异很大。本方法克服了上述缺点，具有下列优点：
1.不需要单独纯化线粒体，操作简单快捷。
2.得到的动物mtDNA只能用于PCR分析，不能用于其它实验。
3.可以用于培养的动物细胞，实体动物组织和血液。每10E7个动物细胞一般能得到100 ng左右的mtDNA，每克实体动物组织一般能得到1-2 ug mtDNA。
4.本产品不能用于纯化植物线粒体DNA（需要另购）。
5.本试剂盒足够50次微量提取。
6.本产品只可用于科研。

规格及成分
本产品用大扁盒包装
成分                                             编号       规格        包装
动物线粒体DNA纯化溶液A     220520a     13 mL    15 mL本色瓶
动物线粒体DNA纯化溶液B     220520b     13 mL    15 mL本色瓶
动物线粒体DNA纯化溶液C     220520c     18 mL    30 mL本色瓶
离心吸附柱                               220144      50套       塑料袋
通用洗柱液                               220143      50 mL    60 mL本色瓶
DNA洗脱液（基因组纯化用）    220125    10 mL    10 mL本色瓶
使用手册                                  220520sc    1份         无

自备试剂
待处理样品，0.25%胰酶消化液，PBS缓冲液，1.5 mL塑料离心管

运输及保存
常温运输与保存，有效期为12个月。

使用方法
一、培养细胞的预先处理（本试剂盒不含相关试剂）
1.用自备的0.25%胰酶消化液处理约10E7个培养的动物细胞，离心收集后弃上清，保留细胞沉淀。
2.用PBS缓冲液洗涤细胞沉淀两次，最后得到的细胞沉淀将直接用作动物mtDNA提取的材料。
二、动物组织细胞预处理（本试剂盒不含相关试剂）
3.用剪刀将1 g新鲜的动物组织剪碎（芝麻大小最好），转移到1.5 mL塑料离心管中，直接用作动物mtDNA提取的材料。注意：不能使用冻存的动物组织，因为冻凝过程中形成的冰晶会将线粒体膜和细胞膜刺破，其DNA已经释放出来，被体液中的DNA酶降解。
三、血液预处理
4.将3-5 mL抗凝外周血静置30分钟或低速离心5分钟，取白细胞层。
5.用自备PBS缓冲液洗涤白细胞两次，得到的白细胞沉淀用于mtDNA提取。
四、线粒体粗提物制备
6.用自选方法将10E7个培养细胞或1 g实体组织匀浆。
7.室温700×g离心6分钟，收集上清。
8.将上清在室温10000×g离心10分钟，得线粒体粗提物沉淀。
五、mtDNA提取
9.在细胞沉淀或剪碎的组织或线粒体粗提物沉淀中加入250 mL冰浴的动物线粒体DNA纯化溶液A，充分吹打分散。如果是剪碎的组织，不要等成块的组织溶解即可继续下步操作。
10.加入250 mL常温的动物线粒体DNA纯化溶液B（如果溶液B有沉淀，用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用），轻柔颠倒混匀10次，不要剧烈振荡。
11.冰上放置6-8分钟。注意不要超过8分钟。
12.加入350 mL冰浴的动物线粒体DNA纯化溶液C，轻柔颠倒混匀6次，可见白色沉淀物产生。冰上放置20分钟。
13.室温13000 g离心10分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大，有时候出现沉淀漂浮是正常现象，取上清时避开漂浮的沉淀即可。
14.静置5分钟以让DNA与离心吸附柱充分结合，此步十分重要。
15.室温13000 g离心1分钟，弃收集管中的废液。
16.加入500 mL的通用洗柱液，室温13000 g离心1分钟，弃收集管中废液。
17.重复上步1次。
18.室温13000 g离心1分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则残留通用洗柱液会影响DNA的后续使用（如DNA上样时不能沉淀到加样孔中）。
19.将离心吸附柱置于一个新的1.5 mL塑料离心管中，加入50 mL DNA洗脱液（基因组纯化用），室温放置2分钟。
20.室温13000 g 离心1分钟，离心管底溶液即mtDNA。每10E7个动物细胞一般能得到100ng左右的 mtDNA，每克实体动物组织一般能得到3-5 mg的mtDNA。如果DNA需要浓缩，可以使用本公司的核酸浓缩剂。本试剂盒得到的mtDNA一般有断裂，电泳时不呈现专一的带，但不影响作为PCR模板。

关联产品
植物线粒体DNA纯化试剂盒

更新备注
V1.1加上线粒体粗体物作为起始材料