CAT#:JW-220516-50
常温运输和保存

细菌RNA纯化试剂盒（过柱法）

产品及特点
本产品用于快速从各种常见的细菌中提取总RNA。本产品具有下列特点:
1.操作简单快速，一般只需30-40分钟完成。
2.既可用于革氏阴性细菌，也可用于革氏阳性细菌。
3.所RNA纯度高，OD260/OD280一般在2.0左右。
4.一般不含基因DNA和蛋白质污染。
5.性价比高于进口同类产品。
6.得到的RNA可用于后续RT-PCR、Northern Blot、芯片分析、体外翻译、polyA筛选和RNase保护分析等试验。
7.本产品可以进行50次微量细菌RNA提取。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用大扁盒包装
名称                                编号        规格    包装
细菌RNA纯化溶液A    220516a    25 mL    30 mL棕色玻璃瓶
细菌RNA纯化溶液B    220516b    25 mL    30 mL本色瓶
溶菌酶干粉                 220516c    30 mg    1.5 mL本色管
离心吸附柱                220144       50套      塑料袋
通用洗柱液               220143        50 mL    60 mL本色瓶
RNA洗脱液               971207      10 mL    10 mL本色瓶
使用手册                   220516sc    1份           1份

运输及保存
常温运输，收到货后，细菌RNA纯化溶液A长期保存需要放4℃，溶菌酶干粉长期保存需要放-20℃，有效期一年。

自备试剂
氯仿。

使用方法
注意：试验所用的实验室环境、耗材等均需要RNase-free。操作步骤是针对在1.5 mL 塑料离心管中进行的微量提取。
1.新鲜配制溶菌酶溶液：根据样品数量用自备的TE缓冲液和本试剂盒提供的溶菌酶干粉配制合适体积的、浓度为4 mg/mL的溶菌酶溶液，放冰上待用。一次革氏阳性细菌RNA小量提取需要100 μL溶菌酶溶液，一次革氏阴性细菌RNA小量提取需要10 μL溶菌酶溶液。未用完的溶菌酶溶液不建议保存后重复使用。
2.在 1.5 mL塑料离心管中离心收集0.2-1.5 mL新鲜细菌（细菌总数不得超过1E9个细菌）。注意:由于细菌RNA半衰期十分短，只有2-5分钟，所以必须使用最新鲜的、处于对数生长期的细菌才能提到高质量的RNA。细菌必须立即使用，不能静置。
3.吸尽液体培养基，如果是革氏阳性细菌，则加入100 μL第1步制备的4 mg/mL的溶菌酶溶液，彻底重悬细菌，常温放置5-10分钟。如果是革氏阴性细菌，则加入90 μL TE缓冲液和10 μL第1步制备的4 mg/mL的溶菌酶溶液，彻底重悬细菌，常温放置3-5分钟。
4.加入0.3 mL细菌RNA纯化溶液A，用枪充分吹打细菌沉淀，确保细菌全部裂解，没有块状物。此时裂解物总体积是0.4 mL。
5.加入约0.2倍体积的自备氯仿(10.4 mL裂解物需0.1 mL氯仿)，振荡器上充分振荡混均30秒。
6.12,000-15,000×g室温离心3分钟。
7.将上清液（约0.3 mL）转移到新的离心管中。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。
8.加入等体积（约0.3 mL）的细菌RNA纯化溶液B，充分混匀后全部上柱。
9.12,000-15,000×g室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
10.加0.7 mL通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的 穿透液。一次洗涤一般足够去除杂质。但如果样品OD260/OD280比值不高，可以再用0.3 mL通用洗柱液重复此步一次。
11.室温12,000-15,000×g离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA的使用。
12.将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free收集管中，加入30-100 μL RNA洗脱液，室温放置两分钟。
13.室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
14.RNA完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使 用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子。
15.RNA产量产率测定：将5-10 μL RNA溶于TE缓冲液中(pH 7.5-8.2之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA的产量（浓度X体积)和产率(RNA产量/组织用量)。
16.RNA 纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。

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