CAT#:JW-220528-30
常温运输和保存，有一低温成份

DNA尿素-PAGE变性电泳试剂盒

产品及特点
本产品是专门用于DNA尿素-PAGE变性电泳的试剂盒，它具有下列特点:
1.一站式，即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。
2.安全，免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品丙烯酰胺。
3.可用于DNA测序、AFLP、DDRT、TGGE和RNase保护实验等。
4.电泳后可直接用于银染、EB染色等实验。
5.本产品足够30次mini尿素-PAGE胶（10cm×10cm）实验。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品第一部分为大纸盒包装，常温运输
成份                                                                      编号         规格        包装材料
尿素                                                                     100873    105g×2    250mL本色瓶
丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺（29:1），电泳级     220528a    62g       250mL棕色瓶
TBE电泳液，10×                                                 90313       250mL    250mL本色瓶
TEMED                                                                110-18-9    1.5 mL    2.0mL白盖管
过硫酸铵                                                                100879     1 g        2.0mL绿盖管
使用手册                                                               220528sc    1份        无
本产品第二部分为塑料袋包装，低温运输
成份                                            编号      规格       包装材料
2×尿素-PAGE变性胶上样液    900874    1.5 mL    2.0mL红盖管

运输及保存
常温运输，保存条件见上表，有效期一年。

自备试剂
去离子水

使用方法
一、PAGE浓度和交联度的选择指南
1.尿素-PAGE变性胶一般使用29：1（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺）的交联度，在此交联度的条件下，DNA片段长度和最适PAGE浓度对应关系如下：
单链DNA长度        最佳PAGE浓度        二甲苯青FF迁移率对应的DNA长度    溴酚蓝迁移率对应的DNA长度
50-400 nt                        8%                                          160 nt                                         45 nt
200-1000 nt                    5%                                           260 nt                                        65 nt
750-2000 nt                    3.5%                                        460 nt                                        100 nt

二、制备尿素-PAGE变性胶
此处以配制100mL尿素-PAGE变性胶为例，如果配制体积不同，则各成分用量需要按比例调整。
2.新鲜配制10%的APS（过硫酸铵）：按每0.1克过硫酸铵干粉加1mL去离子水的比例将水加到装有硫酸铵干粉的1.5 mL EP管中，摇晃到粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周，超过一周必须弃之不用。
3.配制40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液（29：1，简称AB溶液，下同）：在装有丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺干粉的250mL棕色塑料瓶中加入120 mL自备的去离子水，颠倒摇晃溶解后，即得40%的AB溶液。注意：丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
4.配尿素-PAGE变性胶：在一个干净的250 mL玻璃三角瓶中，按下表的用量加入各成分。注意：丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
需要配制的PAGE胶浓度    所需各成分的用量                        补水到
                         尿素     40%AB溶液    10×TBE缓冲液    
5%                    42克       12.5mL          5.0 mL                        100mL
6%                    42克       15.0 mL         5.0 mL                        100 mL
7%                    42克       17.5 mL         5.0 mL                        100 mL
8%                     42克       20.0 mL        5.0 mL                       100 mL
9%                     42克       22.5 mL        5.0 mL                        100 mL
10%                    42克      25.0 mL        5.0 mL                       100 mL
11%                    42克      27.5 mL        5.0 mL                        100 mL
12%                    42克      30.0 mL        5.0 mL                       100 mL
5.搅拌直到所有成分溶解，然后用滤纸过滤。
6.抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气，因为氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应。无条件抽真空也可以跳过此步。
7.加入500uL 10%APS和100uL TEMED后，迅速摇匀后灌胶。
8.在PAGE胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
9.室温聚合30-60分钟。不能放低温，低温会抑制聚合反应。
10.拔出梳子，用0.5×TEB液冲洗加样孔。

三、DNA样品的准备
11.对一般样品、测序样品、微卫星DNA、AFLP样品、DDRT样品、RPA样品：将样品跟2×尿素-PAGE上样液1:1混合，95℃ 3分钟变性，然后放冰上待用。
12.对TGGE样品：可以不加上样液直接放冰上待用。

四：电泳
13.将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够0.5×TEB电泳液。
14.预电泳30分钟，使得PAGE胶发热后，将冰上放置的样品上样。
15.连接电源线，打开电源开关。根据胶的大小选择固定功率进行电泳。固定功率等于固定产热，这样就不容易发生过热而发生PAGE胶板破裂的现象。如果固定电流或电压，产热将随电泳时间而变化，不好控制。对小胶一般用5-6W的固定功率，大胶用15-25W的固定功率。
16.终止电泳，取出凝胶进行后续的处理（如银染）。注意：如果银染，必须延长固定时间以便让洗出尿素，否则胶中残留的尿素会严重干扰后面的银染。
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