氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）浓度比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）浓度比色法定量检测试剂是一种旨在通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应系统中，伴随着氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）还原后吸光峰值的变化，即采用比色法测定样品中NADP含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞或组织裂解萃取液样品（动物、人体、植物、昆虫等）氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）的浓度检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate；NADP）是一种辅酶，又称氧化型辅酶Ⅱ，在很多生物体内具有分解代谢（catabolic）和生物合成的作用。其还原形式为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate；NADPH），存在于细胞糖类代谢过程中。在哺乳动物体内，NADP，通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase；G6PD）的作用，转化为NADPH，成为细胞内主要还原剂，保护活体细胞免受氧化损害。在植物叶绿体内，由铁氧化还原蛋白NADP还原酶（ferredoxin –NADP reductase）的催化，生成NADPH，成为光合作用（卡尔文循环（calvin cycle）的主要还原剂。基于葡萄糖-6-磷酸（D-glucose-6-phosphate）在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase；G6PD）的作用下，转化为6-磷酸葡萄糖酸内脂（6-phosphoglucono-δ-lactone） 产物后，伴随着辅酶因子氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADP）转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADPH），产生吸光峰值的变化，在分光光度仪下（340nm 波长），测定NADP的浓度。其反应方式为：

产品内容
缓冲液（Reagent A）      毫升
反应液（Reagent B）      毫升
阴性液（Reagent C）        毫升
酶促液（Reagent D）    微升
标准液（Reagent E）        微升
产品说明书         1份

保存方式
保存反应液（Reagent B）、酶促液（Reagent D）和标准液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备
1.5毫升离心管：用于标准液配制的容器
比色皿或酶标板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的反应液（Reagent B）、酶促液（Reagent D）和标准液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后进行下列操作。
一、标准液配制
1．准备5管1.5毫升离心管，标记为A至E号管
2．按下表分别加入试剂 ，混匀
管号    缓冲液（Reagent A）        标准液（Reagent E）        测定体系终浓度（NADP）
A    xx微升            xx微升            xx微摩尔/升
B    xx微升            xx微升            xx微摩尔/升
C    xx微升            xx微升            xx微摩尔/升
D    xx微升            xx微升            xx微摩尔/升
E    xx微升            xx微升            xx微摩尔/升
3．放进冰槽里备用，避免光照

二、测定准备
1．准备好待测NADP的样品（例如细胞裂解萃取液样品等），置于冰槽里
2．设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长340nm，并置零
3．缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（Reagent B）
3．加入xx微升阴性液（Reagent C）
4．上下倾倒数次，混匀
5．置于37℃温度下孵育3分钟，避免光照
6．即刻放进分光光度仪检测，此为背景0分钟读数
7．加入xx微升酶促液（Reagent D）
8．上下倾倒数次，混匀
9．置于37℃温度下孵育5分钟，避免光照
10．即刻放进分光光度仪检测，此为背景5分钟读数
11．背景实际读数：5分钟读数－0分钟读数

四、标准样品测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（Reagent B）
3．加入xx微升标准液（Reagent E）
4．上下倾倒数次，混匀
5．置于37℃温度下孵育3分钟，避免光照
6．即刻放进分光光度仪检测，此为标准样品0分钟读数
7．加入xx微升酶促液（Reagent D）
8．上下倾倒数次，混匀
9．置于37℃温度下孵育5分钟，避免光照
10．即刻放进分光光度仪检测，此为标准样品5分钟读数
11．标准样品实际读数：5分钟读数－0分钟读数
12．重复实验步骤1至11，直至测完所有上述配制的5管标准样品

五、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（Reagent B）
3．加入100微升（20微克总蛋白）待测样品（注意：样品须清澈）
4．上下倾倒数次，混匀
5．置于37℃温度下孵育3分钟，避免光照
6．即刻放进分光光度仪检测，此为样品0分钟读数
7．加入xx微升酶促液（Reagent D）
8．上下倾倒数次，混匀
9．置于37℃温度下孵育3分钟，避免光照
10．即刻放进分光光度仪检测，此为样品5分钟读数
11．样品实际读数：5分钟读数－0分钟读数

六、计算样品浓度
1．构建测定体系NADP浓度标准曲线：纵座标（Y）为标准样品吸光值OD340读数，横座标（X）为对应的NADP含量（微摩尔/升）
2．根据标准曲线获得样品对应NADPH浓度
3．计算样品实际NADPH浓度

七、酶标板测定
1．在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照、标准样品和待测样品
2．分别移取xx微升缓冲液（Reagent A）到所有孔中
3．分别加入xx微升反应液（Reagent B）到所有孔中
4．分别加入xx微升阴性液（Reagent C）、5管配制的标准液（Reagent E）、待测样品（10微克总蛋白）到对应孔中
5．轻轻摇动酶标板，混匀
6．置于37℃温度下孵育3分钟，避免光照
7．即刻放进酶标仪检测，此为背景、标准样品或待测样品0分钟读数
8．分别加入xx微升酶促液（Reagent D）到所有孔中
9．轻轻摇动酶标板，混匀
10．置于37℃温度下孵育5分钟，避免光照
11．即刻放进酶标仪检测，此为背景、标准样品或待测样品5分钟读数
12．实际读数：5分钟读数－0分钟读数
13．计算样品浓度
1)构建测定体系NADP浓度标准曲线：纵座标（Y）为标准样品吸光值OD340读数，横座标（X）为对应的NADP含量（微摩尔）
2)根据标准曲线获得样品对应NADP浓度
3)计算样品实际NADP浓度

注意事项
1．本产品为25次（比色皿）和100次（酶标板）操作，包括背景对照、标准样品
2．操作时，避免污染母液
3．操作时，须戴手套
4．系统操作过程中，背景和标准测定只需1次
5．样品须澄清，至关重要
6．孵育时，避免光照
7．加样后即刻比色测定
8．反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由低到高变化；测定持续5分钟
9．比色测定后，比色皿须清洗彻底
10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11．本公司提供系列生化检测试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
编号        名称                规格        
G&VS10090    NADP浓度比色法定量检测试剂盒        20/80次        
G&VS10090A    缓冲液（Reagent A）            100毫升
G&VS10090B     反应液（Reagent B）            10毫升
G&VS10090C     阴性液（Reagent C）            10毫升
G&VS10090D     酶促液（Reagent D）        1毫升
G&VS10090E    标准液（Reagent E）            1毫升

产品编号        名称                规格
G&VS50005    NADH浓度比色法定量检测试剂盒    20/80次
G&VS50124    NAD浓度比色法定量检测试剂盒        20/80次
G&VS50067    NADPH浓度比色法定量检测试剂盒    20/80次
G&VS10090     NADP浓度比色法定量检测试剂盒    20/80次