通用型细胞培养污染性支原体属鉴定 16S rDNAPCR 扩增检测试剂盒产品说明书

主要用途
通用型细胞培养污染性支原体属鉴定 16S rDNAPCR 扩增检测试剂是一种旨在根据保守性序列设 计引物，针对支原体样本 DNA 进行 PCR 扩增，进一步电泳检测其特异性条带，确认支原体污染的权威而 经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种生物样品，尤其是人 体和动物细胞培养中支原体属污染检测。产品即到即用，性能稳定，操作简便，扩增效率显著。

技术背景
支原体(mycoplasma) 属于柔膜细菌目(Mollicutes)，是最小(0.2 至 2 微米) 也是最简单(580 至 2200kbp) 的寄生类生物。其缺乏肽聚糖(peptidoglycan)细胞壁。支原体是人体非典型型肺炎的病原体。由于支原 体具有青霉素和链霉素抗性、无法通过过滤去除，成为细胞培养中常见的污染微生物：改变细胞表型和生 长特征。其中占 80  至 90%的细胞培养污染性支原体是发酵支原体(M.fermentans)、猪鼻支原体     (M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、人型支原体(M.hominis)、精氨酸支原体(M.arginini) 和莱氏无 胆甾原体(A.laidlawii)等。16SrRNA 作为非培养依赖性标记的分子指模(fingerprinting) 技术， 有别于传 统的耗时且难以培养存活的选择性培养技术，用于研究微生物的分类学(phylogenetics)。核糖体 RNA      (ribosome RNA)存在于所有微生物体内，且结构与功能进化保留；容易分离和识别；其一级和二级结构 具有高度进化保守区域(conserved region) 和物种特异性可变区域(variable region)；其基因序列变异非常 缓慢，且不会发生平行基因转移(horizontal  gene  transfer)。其包括 5S 、16S 、23S。其中 16S 以及 16S 和 23S 之间的交接区域特异性强。通过引物设计， 扩增产物， 在凝胶电泳上呈现特异性条带， 或进一步测序， 数据库对照，确定支原体种系(species)。

产品内容
扩增液(Reagent A)    xx 微升
引物液(Reagent B)    xx 微升
补充液(Reagent C)    xx 毫升
测序引物(Reagent D)    xx 微升(另购)
产品说明书    1 份

保存方式
保存在－20℃冰箱里；有效保证 6 月

用户自备
PCR 级矿物油：用于封隔反应液
PCR 仪：用于样品扩增
PCR 管或平板：用于 PCR 反应的容器
琼脂糖凝胶电泳：用于扩增后电泳分析

实验步骤
实验开始前，从－20℃冰箱中取出试剂，放进冰槽里融化。然后进行下列操作：
一、  样品准备
1.     移取 1 毫升细胞培养液上清到 1.5 毫升离心管
2.     放进微型台式离心机瞬时离心 10 秒
3.     小心移取上清液到新的 1.5 毫升离心管
4.     放进微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 16000g  (或 13000RPM；例如 eppendorf 5415)
5.     小心抽去上清液，保留沉淀颗粒(注意：肉眼难以见到颗粒)
6.     加入 xx 微升 补充液(Reagent C)，枪头抽吸混匀
7.     放进 95℃干式恒温仪孵育 3 分钟
8.     放进-20℃冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、扩增反应
1 ．  针对一个样本，每次移出 xx 微升 扩增液(Reagent A) 到 PCR 管
2 ．  加入 xx 微升用户自备的的待测 DNA 样品(最低量 10 皮克)
3 ．  加入 xx 微升 引物液(Reagent B)
4 ．  再加入 xx 微升 补充液(Reagent C) (反应总量为 25 微升)
5 ．  即刻放进微型台式离心机瞬时离心 5 秒
6 ．   (选择步骤)加入 50 微升用户自备的 PCR 级矿物油(注意： 参见注意事项13)
7 ．  即刻进行热启动 PCR 反应：

温度(℃)    时间    循环
95    2 分钟    1
95
55
70    1 分钟
    1 分钟
    2 分钟    
40
70    5 分钟    1

8．  反应完毕后，移取 xx 微升进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳：产物为 280bp
9．  如果继续测序鉴定，胶回收 PCR 产物(建议使用高质纯化胶回收试剂盒； G&VS20007.2)
10．移出 xx 微升用户自备的测序反应液到新的 1.5 毫升离心管
11．加入 xx 微升 测序引物(Reagent D)
12．进行后续的测序反应

注意事项
1 ．  本产品为 20 次操作
2 ．  本产品不适宜于临床组织样本和细菌样本的支原体检测
3 ．  本产品可以检测 40 多种支原体种系，包括 M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium  M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、U.urealyticum、 M.neurolyticum、M.genitalium、M.neurolyticum、M.cullis、M.muris、A.laidlawii 和 Spiroplasma  等
4 ．  操作时，须戴手套
5 ．  建议使用带滤芯的枪头，避免污染
6 ．  如果要获得高质 DNA 样品， 建议使用DNA 纯化试剂盒
7 ．  在－20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融
8 ．  可以直接使用纯化的基因组 DNA 进行测序
9 ．  可以将扩增产物纯化后，克隆到质粒中，然后进行测序
10．根据用户 PCR 仪的性能，决定是否加入矿物油(Mineral Oil)
11．建议使用软件测算 Tm 温度；参考公式为 Tm=4  (G+C) +2  (A+T)
12．本公司提供常见种属专一性支原体 16SrDNA PCR 扩增检测试剂盒
13 ．如果测序，其序列分析和微生物分类分析工具参考如下：
1)样品序列与数据库已知微生物序列的比对(BLAST)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
2) 16SrRNA 数据库
http://www.mikro.biologie.tu-muenchen.de
14．本公司提供系列支原体检测试剂产品

质量标准
1 ．  本产品经鉴定性能稳定
2 ．  本产品经鉴定无核酶污染
3 ．  本产品经鉴定检测准确

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货 后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定， 保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题， 请立即以书面形式(实验报 告)与本公司联系， 并将该产品退回， 经检验确系产品质量所致， 本公司负责更换产品。如系使用者错误 操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK ，  RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

产品编号        名称                            规格
G&VS10058    细胞培养细菌污染定性荧光检测试剂盒                20 次
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G&VS10070    细胞培养病毒污染溶斑法中性红染色试剂盒                20 次
G&VS10088. 1    通用型细胞培养污染性支原体属鉴定 16S rDNAPCR 扩增检测试剂盒    20 次
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G&VS10088.3    细胞培养污染性支原体 M.fermentans 鉴定 16S rDNAPCR 扩增检测试剂盒    20 次
G&VS10088.4    细胞培养污染性支原体 M.hyorhinis 鉴定 16S rDNAPCR 扩增检测试剂盒    20 次
G&VS10088.5    细胞培养污染性支原体 M.orale 鉴定 16S rDNAPCR 扩增检测试剂盒    20 次
G&VS10088.6    细胞培养污染性支原体 M.hominis 鉴定 16S rDNAPCR 扩增检测试剂盒    20 次
G&VS10088.7    细胞培养污染性支原体 M.arginini 鉴定 16S rDNAPCR 扩增检测试剂盒    20 次
G&VS10088.8    细胞培养污染性支原体A.laidlawii 鉴定 16S rDNAPCR 扩增检测试剂盒    20 次
G&VS10089    细胞培养抗支原体污染试剂盒                        10 次