通用型细胞培养污染性支原体属鉴定16S rDNA PCR扩增检测试剂盒产品说明书

主要用途
通用型细胞培养污染性支原体属鉴定16S rDNA PCR扩增检测试剂是一种旨在根据保守性序列设计引物，针对支原体样本DNA进行PCR扩增，进一步电泳检测其特异性条带，确认支原体污染的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种生物样品，尤其是人体和动物细胞培养中支原体属污染检测。产品即到即用，性能稳定，操作简便，扩增效率显著。

技术背景
支原体（mycoplasma）属于柔膜细菌目（Mollicutes），是最小（0.2至2微米）也是最简单（580至2200kbp）的寄生类生物。其缺乏肽聚糖（peptidoglycan）细胞壁。支原体是人体非典型型肺炎的病原体。由于支原体具有青霉素和链霉素抗性、无法通过过滤去除，成为细胞培养中常见的污染微生物：改变细胞表型和生长特征。其中占80至90%的细胞培养污染性支原体是发酵支原体（M.fermentans）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）、口腔支原体（M.orale）、人型支原体（M.hominis）、精氨酸支原体（M.arginini）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）等。16SrRNA作为非培养依赖性标记的分子指模（fingerprinting）技术，有别于传统的耗时且难以培养存活的选择性培养技术，用于研究微生物的分类学（phylogenetics）。核糖体RNA（ribosome RNA）存在于所有微生物体内，且结构与功能进化保留；容易分离和识别；其一级和二级结构具有高度进化保守区域（conserved region）和物种特异性可变区域（variable region）；其基因序列变异非常缓慢，且不会发生平行基因转移（horizontal gene transfer）。其包括5S、16S、23S。其中16S以及16S和23S之间的交接区域特异性强。通过引物设计，扩增产物，在凝胶电泳上呈现特异性条带，或进一步测序，数据库对照，确定支原体种系（species）。  

产品内容
扩增液（Reagent A）        微升
引物液（Reagent B）        微升
补充液（Reagent C）        毫升
测序引物液（Reagent D）    微升（另购）
产品说明书         1份

保存方式
保存在－20℃冰箱里；有效保证6月

用户自备
PCR级矿物油：用于封隔反应液
PCR仪：用于样品扩增
PCR管或平板：用于PCR反应的容器
琼脂糖凝胶电泳：用于扩增后电泳分析

实验步骤
实验开始前，从－20℃冰箱中取出试剂，放进冰槽里融化。然后进行下列操作：
一、样品准备
1．移取1毫升细胞培养液上清到1.5毫升离心管
2．放进微型台式离心机瞬时离心10秒
3．小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
4．放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
5．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒（注意：肉眼难以见到颗粒）
6．加入xx微升补充液（Reagent C），枪头抽吸混匀
7．放进95℃干式恒温仪孵育3分钟
8．放进-20℃冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、扩增反应
1．针对一个样本，每次移出xx微升扩增液（Reagent A）到PCR管
2．加入1微升用户自备的的待测DNA样品（最低量10皮克）
3．加入xx微升引物液（Reagent B）
4．再加入xx微升补充液（Reagent C）（反应总量为25微升）
5．即刻放进微型台式离心机瞬时离心5秒
6．（选择步骤）加入50微升用户自备的PCR级矿物油（注意：参见注意事项10）
7．即刻进行热启动PCR反应：
温度（℃）    时间        循环
95        2分钟        1
95
55
70        1分钟
        1分钟
        2分钟    
40
70        5分钟        1

8．反应完毕后，移取5微升进行1.5%琼脂糖凝胶电泳：产物为280bp
9．如果继续测序鉴定，胶回收PCR产物（建议使用高质纯化胶回收试剂盒；G&VS20007.2）
10．移出2微升用户自备的测序反应液到新的1.5毫升离心管
11．加入xx微升测序引物液（Reagent D）
12．进行后续的测序反应

注意事项
1．本产品为20次操作
2．本产品不适宜于临床组织样本和细菌样本的支原体检测
3．本产品可以检测40多种支原体种系，包括M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、U.urealyticum、M.neurolyticum、M.genitalium、M.neurolyticum、M.cullis、M.muris、A.laidlawii和Spiroplasma 等
4．操作时，须戴手套
5．建议使用带滤芯的枪头，避免污染
6．如果要获得高质DNA样品，建议使用DNA纯化试剂盒
7．在－20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融
8．可以直接使用纯化的基因组DNA进行测序
9．可以将扩增产物纯化后，克隆到质粒中，然后进行测序
10．根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）
11．本公司提供常见种属专一性支原体16SrDNA PCR扩增检测试剂盒
12．如果测序，其序列分析和微生物分类分析工具参考如下：
1）样品序列与数据库已知微生物序列的比对（BLAST）
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
2）16SrRNA数据库
http://www.mikro.biologie.tu-muenchen.de
13．本公司提供系列支原体检测试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定无核酶污染
3．本产品经鉴定检测准确

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                        规格    
G&VS10088.1    通用型细胞培养污染性支原体属鉴定PCR扩增检测试剂盒        20次
G&VS10088.1A     扩增液（Reagent A）                    毫升
G&VS10088.1B     引物液（Reagent B）                    毫升
G&VS10088.1C     补充液（Reagent C）                    毫升
G&VS10088.1D     测序引物液（Reagent D）                毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                            规格
G&VS10058    细胞培养细菌污染定性荧光检测试剂盒                20次
G&VS10069    细胞培养病毒污染溶斑法结晶紫染色试剂盒                20次
G&VS10070    细胞培养病毒污染溶斑法中性红染色试剂盒                20次
G&VS10088.1    通用型细胞培养污染性支原体属鉴定16S rDNAPCR扩增检测试剂盒        20次
G&VS10088.2    细胞培养污染性支原体荧光染色鉴定试剂盒                20/100次
G&VS10088.3    细胞培养污染性支原体M.fermentans鉴定16S rDNAPCR扩增检测试剂盒    20次
G&VS10088.4    细胞培养污染性支原体M.hyorhinis鉴定16S rDNAPCR扩增检测试剂盒    20次
G&VS10088.5    细胞培养污染性支原体M.orale鉴定16S rDNAPCR扩增检测试剂盒        20次
G&VS10088.6    细胞培养污染性支原体M.hominis鉴定16S rDNAPCR扩增检测试剂盒    20次
G&VS10088.7    细胞培养污染性支原体M.arginini鉴定16S rDNAPCR扩增检测试剂盒    20次
G&VS10088.8    细胞培养污染性支原体A.laidlawii鉴定16S rDNAPCR扩增检测试剂盒    20次
G&VS10089    细胞培养抗支原体污染试剂盒                    10次