CAT#:JW-220325
低温运输，-20℃保存

酵母菌落PCR试剂盒

产品及特点
菌落PCR是筛选重组子的有效方法，可以使质粒鉴定过程从两天缩短到几小时。但如果宿主是酵母，其菌落PCR的难点则是破壁，因为酵母的细胞壁比 细菌坚韧许多。本产品是基于玻璃珠破壁方法而开发的酵母菌落PCR产品，它具有下列特点：
1.破壁效率高，甚至可以用于野生型酵母。
2.既可用酵母菌落，也可用酵母培养液。
3.条件温和，菌落PCR可以扩增长达3 kb的DNA。
4.既可小规模筛选，也适用于大规模筛查。
5.高灵敏度，既可用于扩增酵母质粒，也可以用于扩增酵母基因组DNA。
6.PCR反应液中含有惰性电泳染料，反应后可直接上样电泳，不需另加上样液。
7.处理过的酵母菌落样品低温长期保存后仍能用于PCR筛查。
8.本产品足够100次 60 μL体系的酵母菌落PCR（细菌菌落PCR需要用另一款产品，编号编号221139）。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成  份                                                           编号          规格            包装
酵母破壁液                                             220325a         2×1 mL        1.5 mL绿盖管
2×PCR MasterMix （菌落筛选专用）    11-220325b     2×1.5 mL    1.5 mL红盖管
酸洗玻璃珠400-600 μm                          220126            3 g             2.0 mL本色管
使用手册                                                 220325sc        1份             1份

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂
 酵母菌落，模版专一性引物，TE缓冲液。

使用方法
一、酵母破壁
1.如果有N个样本，则标记N+2个1.5 mL的塑料离心管，N个用于样本，
一个用于阳性对照PC（Positive Control，确认有质粒阳性的样本），一个
用于阴性对照NC（Negative Control，可以用水代替）。
2.在每个管中加入20 μL酵母破壁液。
3.挑入一个新鲜酵母菌落（芝麻大小即可）或2 μL酵母饱和菌液。
4.加入体积跟酵母破壁液相当的酸洗玻璃珠（重量在20-30 mg）。
5.涡旋震荡3分钟。
6.常温10000 rpm离心半分钟后可以直接取上清作为模板立即进行PCR。如
果不立即进行PCR，需将上清全部转移到新离心管中（至少可以取出15 μL）， 再加入等体积的自备TE缓冲液，放-20℃待用。TE缓冲液中的EDTA可以抑制样本中残留DNase的活性，可以使DNA的放置时间更长。
二、PCR 扩增
7. 在一个 1.5 mL 的预冷塑料离心管中分别加入下列预冷成份并充分混匀 ，
得到PCR预混液并放冰上待用。由于有N+2个样本，所以配制时多加一个，
按 N+3 计算：
成份                                            N+2个样品管
自备超纯水                                27 μL×（N+3）
自备PCR引物F，10 uM            1 μL×（N+3）
自备PCR引物R，10 uM            1 μL×（N+3）
2×PCR MasterMix
（菌落筛选专用）                    30 μL×（N+3）
合计                                         59 μL×（N+3）
7.将上步得到的预冷PCR预混液按59 μL/管分装到N+2个标记并且预
冷的PCR管中。
8.将第6步制备的N+2个样品各取1 μL加入上步加有59 μL混合液的PCR  
管中。PC样到PC管，NC样到NC管，1号样品加入到1号PCR管中，以
此类推。由于裂解液含大量PCR抑制物，样本用量不要超过1.5 μL，否则样本加得越多，PCR越容易被抑制。
9.将N+2个预冷的PCR管快速放入PCR仪器中进行扩增，PCR温度参数根
据引物和模板情况由客户自己预先确定。
10.PCR结束后直接取10 μL电泳直接进行琼脂糖电泳分析。本试剂盒提供的  
PCR MasterMix（菌落筛选专用）中已经含有电泳示踪剂和促沉剂，故可以
直接上样。橙黄色电泳染料的泳动速度对应于50 bp的DNA，蓝色电泳染料的泳动速度对应于3-5 kb的DNA。
11.如果阴性对照NC有预期大小的扩增产物，则无论阳性对照PC和N个样
本的结果如何，整个实验无效。说明环境污染，需要解决污染问题再继续。如果阳性对照PC没有预期大小的片段，且没有任何样本呈现阳性，则很可能是试剂、程序、引物、仪器等有问题，需要解决问题后再继续。如果有任 何一个样本呈现阳性（不包括阴性对照），则实验有效，可以继续分析每个样品。
12.如果阳性对照有预期大小的片段，阴性对照没有，则整个实验有效。可以
分析每个样品。每个样品如果有预期大小的扩增产物，则初步判断为阳性。如果没有，则判断为阴性。
13.对阴性样本，可以用超纯水将其稀释10倍、百倍、千倍、万倍4个稀释度，
然后一起再进行 PCR 检测，如果某个稀释度的样本出现预期扩增产物，则测试时需要先将样本稀释到该稀释度后再测。
14.可以将阳性样品对应的菌落再挑出来进行培养并进行进一步的分析。

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