CAT#:JW-220316-5
低温运输、-20℃保存

随机引物法DNA探针地高辛标记试剂盒

产品及特点
本产品是基于Feinberg和Vogelstein发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA探针标记试剂盒，标记过程由双链DNA热变性、随机引物与单链DNA结合、在Klenow DNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探针并掺入标记的核苷酸三步组成，可用下面的示意图表示：

本产品对Feinberg和Vogelstein经典方法进行了改良，具有下列特点：
1.提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分，简化了反应加样步骤，提高了标记反应的可重复性。
2.使用无外切活性的Klenow exo- DNA聚合酶，已标记DNA探针不会被酶降解，探针产量更高。
3.快速，最快1小时即可完成标记反应。
4.所需模版DNA量少，模板可以是线状或环状的、也可以是单链或双链的，但长度必须在100 bp以上。
5.得到的探针长度一般在200-400 nt之间（如果模板长度在1kb以上），可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
6.本产品足够5次DNA探针地高辛标记实验。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用五孔盒包装
成份                                                 编号         规格            包装
5×随机引物地高辛标记反应液    220316a          20 uL    0.5mL绿盖管
随机引物(6碱基，无修饰)干粉    220574            5次       0.5mL本色盖管
Klenow exo-聚合酶，5U/uL       11-N221021     5 uL     0.5mL红盖管
超纯水                                        100935            1 mL     1.5mL蓝盖管
使用手册                                     220316sc        1份        无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
模板DNA。

使用方法
1.首次使用本产品时，需要在随机引物干粉管子中加入25uL超纯水，涡旋震荡30秒，短暂离心10秒。得随机引物溶液，放冰上待用。
2.在一干净的塑料离心管中加入下列成分：
成分                                                                          用量
模板DNA（PCR回收片段,长度100-1000bp）           50-150 ng
5×随机引物地高辛标记反应液                                   4 uL
随机引物溶液                                                             4 uL
超纯水                                                                        补水到19 uL
注意：模板DNA并非越多越好，因为模板DNA没有标记，新合成的DNA才带有标记，因此模板DNA越多，在杂交反应时这些没有标记的DNA对标记DNA的竞争性抑制就越强，最后降低杂交信号强度。
3.PCR仪上100℃加热10分钟使模板DNA彻底变性。
4.立即放冰上待用。不能缓慢降温，否则变性的模板DNA单链又会杂交形成双链。
5.离心数秒使所有液体集中在管底。
6.加入1 uL Klenow exo DNA聚合酶，轻柔吹打混匀。此时反应总体积为20uL。
7.37℃保温1-20小时。标记效率跟模板DNA和保温时间相关，模板越多，新合成探针多，但新合成探针/模板比例低，杂交信号低。模板越少，新合成探针少，但探针/模板比例高，杂交信号高。但探针少到一定程度，也不会有杂交反应发生。因此用户需要探针合成量和杂交信号强弱在这两者之间进行折衷选择。具体可以参考下表：
模版DNA用量（ng）     1小时后探针合成量（探针/模板比例）      20小时后探针合成量（探针/模板比例）
10                                         80ng（8）                                                   900ng（90）
30                                        150ng（5）                                                 1350ng（45）
100                                      350ng（3.5）                                              1650ng（16.5）
300                                      750ng（2.5）                                               2200ng（7.3）
1000                                   1300ng（1.3）                                              2600ng（2.6）
3000                                   1600ng（0.53）                                            2600ng（0.87）
8.反应结束后加热100℃ 5分钟使DNA聚合酶变性，同时使DNA探针变性成单链。变性后的标记反应液可以放-20℃长期保存，也可以直接将变性后的探针加入到杂交反应液中进行杂交。如果电泳检测，标记产物将是弥散状态。
注意：本方法标记核苷酸掺入率极高，因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化，不要用酚抽提法纯化非同位素标记的DNA探针，因为这些标记分子（如生物素或地高辛等）疏水性强，能使标记的DNA进入疏水的有机相而丢失。只能选择乙醇直接沉淀或Sephadex G50过柱回收（需另购柱式探针纯化试剂盒）。

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柱式探针纯化试剂盒。