CAT#:JW-220314-5
低温运输、-20℃保存

随机引物法DNA探针标记试剂盒（自备标记核苷酸型）

产品及特点
本产品是基于Feinberg和Vogelstein发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA探针标记试剂盒，标记过程由双链DNA热变性、随机引物与单链DNA结合、在Klenow DNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探针并掺入标记的核苷酸三步组成，可用下面的示意图表示：

本产品对Feinberg和Vogelstein经典方法进行了改良，具有下列特点：
1.提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分，简化了反应加样步骤，提高了标记反应的可重复性。
2.使用无外切活性的Klenow exo- DNA聚合酶，已标记DNA探针不会被酶降解，探针产量更高。
3.快速，最快1小时即可完成标记反应。
4.得到的DNA探针比活性高（如果是同位素，可以达到10E9 cpm/ug DNA）。
5.所需模版DNA量少，模板可以是线状或环状的、也可以是单链或双链的，但长度必须在100 bp以上。
6.得到的探针长度一般在200-400 nt之间（如果模板长度在1kb以上），可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
7.本产品足够5次标记实验。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用十孔盒包装
成份                                    编号            规格        包装
10×随机引物标记反应液
(自备标记核苷酸型)             220314a     10 uL    0.5mL绿盖管
Klenow exo-聚合酶              220314b     5 uL      0.5mL红盖管
dATP，2 mM                       220314c     10 uL    0.5mL白盖管
dTTP，2 mM                       220314d     10 uL    0.5mL紫盖管
dGTP，2 mM                      220314e     10 uL     0.5mL蓝盖管
dCTP，2 mM                      220314f      10 uL     0.5mL黄盖管
标记专用随机引物溶液        220314g      10 uL    0.5mL橙盖管
超纯水                                 210806        1mL     1.5mL本色管
使用手册                             220314sc     1份       无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
0.5M EDTA（pH8.0），需要自备标记的核苷酸。

使用方法
注意：随机引物标记效率跟起始模板量和保温时间相关，杂交时需要探针DNA必须达到一定的浓度，其中探针/模板比越高，没有标记的模板DNA对杂交的竞争性抑制越低。用户在实验前可以根据下表选择合适的起始模板量和保温时间：
起始模版DNA用量（单位：ng）    1小时后探针合成量（探针模板比）     20小时后探针合成量（探针模板比）
10                                                     80ng（8）                                            900ng（90）
30                                                   150ng（5）                                          1350ng（45）
100                                              350ng（3.5）                                         1650ng（16.5）
300                                              750ng（2.5）                                           2200ng（7.3）
1000                                          1300ng（1.3）                                            2600ng（2.6）
3000                                        1600ng（0.53）                                          2600ng（0.87）
               
1.在一干净的硅化的塑料离心管中加入下列成分：
成分                                    用量
模板DNA                           50-150 ng
随机引物                            2 uL
10×随机引物标记反应液    2 uL
超纯水                               补水到15 uL
注意：非同位素标记基团（如生物素和地高辛）疏水性强，易与塑料离心管表面非特异性结合，所以要硅化塑料离心管。模板DNA并非越多越好，否则没有标记的模板DNA在杂交时会竞争性地抑制标记DNA跟靶分子的杂交，反而降低杂交信号强度。
2.沸水浴10分钟，或在PCR仪上100℃加热10分钟彻底变性模板DNA，结束后需要立即放冰上待用。不能缓慢降温，否则变性的模板DNA单链又会杂交形成双链。
3.离心数秒使所有液体集中在管底，如果标记物为dTTP则加入除dTTP之外的三种核苷酸（dATP、dGTP、dCTP）各1 uL（共3uL，浓度均为2mM），自备的dTTP/标记dUTP混合物1uL，最后加入1 uL Klenow exo聚合酶。如果标记物为dCTP则加入除dCTP之外的三种核苷酸（dATP、dGTP、dTTP）各1 uL，以此类推。
注：dTTP/标记dUTP混合物中dTTP和标记dUTP的总浓度必须达到2mM，dTTP与生物素标记dUTP或地高辛标记的dUTP的比例在65：35为最佳。但如果使用自备的其他标记核苷酸，如fluorescein、hydroxycoumarin、resorufin和aminoallyl标记的dUTP，则用户需要自己摸索其与dTTP之间的最佳比例，如果使用32P标记的dUTP，则比活最好为3000Ci/mmol，浓度为好为10uCi/uL，并且不需要加入dTTP。
4.轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上，离心数秒使所有液体集中在管底。
5.37℃保温1-20小时。反应结束后加热100℃ 5分钟使DNA聚合酶变性，同时使DNA探针变性成单链，然后立即冰上冷冻。不能缓慢降温，否则变性的模板DNA单链又会杂交形成双链。
6.变性后的标记反应液可以放-20℃长期保存，也可以直接加入到杂交反应液中进行杂交。如果电泳检测，标记产物将是弥散状态。
注意：本方法标记核苷酸掺入率极高，因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化，不要用酚抽提法纯化非同位素标记的DNA探针，因为这些标记分子（如生物素或地高辛等）疏水性强，能使标记的DNA进入疏水的有机相而丢失。只能选择乙醇直接沉淀或Sephadex G50过柱回收（需另购柱式探针纯化试剂盒）。对比活高的同位素标记探针，由于同位素其极其不稳定，因此应该立即使用，不要长久放置。

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