动物肝星状细胞分离培养试剂盒产品说明书

主要用途
动物肝星状细胞分离培养试剂是一种旨在从动物活体肝组织中分离出活力保证、高度纯化的原代细胞株的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种动物肝星状细胞的制备。其制备产量高，活力保证，纯度可达90％。可以被用于细胞与细胞之间和细胞与基质之间相互作用的分析，以及肝纤维化、肝硬化、肝再生等的研究。产品即到即用，严格无菌、性能稳定，分离产量和纯度堪称同类产品最佳。

技术背景
肝星状细胞（Hepatic stellate cells；HSC），也称为Ito细胞、维生素A储存细胞、脂肪细胞、或脂肪储存细胞。其位于实质细胞（parenchymal cell）和内皮细胞（endotherial lining）之间，具有维甲类化合物储存和体内平衡、胞外基质重建、生长因子和细胞因子的制造、窦腔收缩和舒张、肝组织发育和再生的功能，与肝纤维化的发生和肿瘤转移有关。

产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
酶解液（Reagent B）        毫升
强化液（Reagent C）        毫升
平衡液（Reagent D）        毫升
净化液（Reagent E）        毫升
离心液（Reagent F）        毫升
培养液（Reagent G）       毫升
产品说明书                          1份

保存方式
保存酶解液（Reagent B）、强化液（Reagent C）、平衡液（Reagent D）和净化液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里，离心液（Reagent F），避免光照；有效保证6月

用户自备
2升三角烧瓶：用于盛放麻醉动物的容器
乙醚：用于麻醉动物
手术器械：用于解剖动物
18号静脉穿刺针：用于静脉灌注
恒温水浴摇床：用于孵育反应
15毫升锥形离心管：用于细胞制备的容器
50毫升锥形离心管：用于组织收集后
1毫升无菌塑料吸管：用于提取细胞
75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿：用于原代细胞培养的容器
4℃台式离心机：用于沉淀细胞
光学显微镜：用于观察细胞形态

实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于冰槽里冻融，同时将培养液（Reagent G）置于37℃恒温水槽预热。然后进行下列操作。
1．准备1个2升三角烧瓶
2．放入300至500克左右的大鼠
3．注入2毫升乙醚，盖上（注意：剂量过高或过低，会影响肝脏供体的质量）
4．观察大鼠，直至其四肢瘫软、背部肌肉松驰
5．取出大鼠，局部消毒
6．手术剖腹：上腹部十字形切口
7．游离肝脏，并找到门静脉和下腔静脉
8．剪开下腔静脉，使静脉血放掉
9．封扎下腔静脉
10．使用18号静脉穿刺针在脾静脉开口平面以下穿刺门静脉
11．缓慢由门静脉注入xx毫升4℃预冷的清理液（Reagent A）
12．室温下静置2分钟 （注意：通过下腔静脉去除上述溶液）
13．再次缓慢注入xx毫升4℃预冷的酶解液（Reagent B）
14．室温下静置10分钟（注意：通过下腔静脉去除上述溶液）
15．继续缓慢注入xx毫升4℃预冷的强化液（Reagent C）
16．放进37℃培养箱里静置30分钟（注意：可以保留强化液（Reagent C））
17．手术切除并剥离肝脏
18．即刻用刀片切碎组织
19．放进50毫升锥形离心管
20．加入xx毫升4℃预冷的平衡液（Reagent D）
21．（选择步骤）4℃温度下，使用组织匀浆器匀化组织（注意：如果刀切效果欠佳）
22．放进37℃恒温水浴摇床孵育30分钟，速度为50RPM（注意：严格无菌）
23．（选择步骤）使用尼龙网（100至200微米孔径）过滤
24．放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为50g  
25．小心移取上清液到新的15毫升锥形离心管
26．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为450g
27．小心抽掉上清液（注意：避免过多液体残留）
28．加入xx毫升净化液（Reagent E），混匀细胞颗粒群
29．加入xx毫升离心液（Reagent F），轻柔上下倾倒，充分混匀（注意：使用前，摇匀离心液（Reagent F））
30．放进4℃台式离心机离心20分钟，速度为1450g（注意：离心刹车为0）
31．小心取出离心管，可见上层和顶面弥散的白色样品带（此为肝星状细胞）
32．用1毫升无菌塑料吸管小心吸取白色样品带
33．移入到新的15毫升锥形离心管
34．加入xx毫升净化液（Reagent E）
35．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为450g
36．小心抽去上清液
37．加入xx毫升37℃预热的培养液（Reagent G），混匀细胞颗粒群
38．转移到75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿
39．放进37℃二氧化碳细胞培养箱孵育48小时贴壁生长
40．更换培养液（Reagent G）
41．光学显微镜观察：静止型肝星状细胞－脂肪滴胞浆，细胞狭小，细胞核偏离中心
42．（选择步骤）或295nm波长下可见维生素A自发荧光现象
43．以后，每间隔48小时更换培养液（Reagent G）一次，直至细胞生长铺满培养瓶或培养皿平面
44．7至10天后的细胞为激活型肝星状细胞－形态呈现为肌成纤维细胞（myofibroblast；MFB）形状；细胞变长，没有脂肪滴

注意事项
1．本产品为5次操作
2．本产品适合小鼠和人体肝星状细胞分离
3．本产品适合各种周龄的大、小鼠
4．注意调整小鼠麻醉剂量
5．所有操作均须在4℃或以下状态进行
6．所有操作均须在无菌状态下进行
7．建议严格控制操作时间：建议小鼠的强化液（Reagent C）和平衡液（Reagent D）孵育时间为大鼠的二分之一
8．用户根据实际情况，调整试剂用量：建议小鼠剂量为大鼠剂量的五分之一
9．在使用清理液（Reagent A）灌注前，用户可以使用生理盐水清除血液一次
10．本产品所获得的肝星状细胞纯度（可达到90％）和产量（2－10 X 105细胞/克组织）
11．使用离心液（Reagent F）前，须摇匀后加入；并注意避免污染母液
12．含有样品的净化液（Reagent E）和离心液（Reagent F）容量之比为1:1
13．分离的肝星状细胞活力检测建议使用细胞活力台盼蓝染色试剂盒－G&VS10009
14．肝星状细胞的鉴定可以使用DESMIN抗体免疫组化染色
15．用户根据需要，可以加入胰岛素（0.02 IU/毫升）或PDGF生长因子（40纳克/毫升）或TGF因子（10纳克/毫升）到肝星状细胞培养液中
16．本公司提供系列细胞培养产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定分离的细胞维持正常活性
3．本产品经鉴定分离的细胞纯度达90％

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                规格        
G&VS10068.1    动物肝星状细胞分离培养试剂盒        5次
G&VS10068.1A    清理液（Reagent A）            毫升
G&VS10068.1B    酶解液（Reagent B）            毫升
G&VS10068.1C    强化液（Reagent C）            毫升
G&VS10068.1D    平衡液（Reagent D）        毫升
G&VS10068.1E    净化液（Reagent E）            毫升
G&VS10068.1F    离心液（Reagent F）            毫升
G&VS10068.1G    培养液（Reagent G）        毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                规格
G&VS10068.1    动物肝星状细胞分离培养试剂盒        5次
G&VS10068.2    动物肝细胞分离培养试剂盒        5次
G&VS10291    动物新生心肌细胞分离培养试剂盒    5次
G&VS10292    动物脂肪组织细胞分离培养试剂盒     10次
G&VS10293    动物肾上腺组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10294    动物骨组织细胞分离培养试剂盒        10次
G&VS10295    动物脑组织细胞分离培养试剂盒        10次
G&VS10296    动物软骨组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10297    动物直肠组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10298    动物内皮细胞分离培养试剂盒        10次
G&VS10299    动物上皮细胞分离培养试剂盒        10次
G&VS10300    动物眼组织细胞分离培养试剂盒        10次
G&VS10301    动物心脏组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10302    动物小肠组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10303    动物肾脏组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10304    动物肝组织细胞分离培养试剂盒        10次
G&VS10305    动物肺组织细胞分离培养试剂盒        10次
G&VS10306    动物淋巴结组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10307    动物乳腺组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10308    动物肌肉组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10309    动物神经组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10310    动物胰腺组织细胞分离培养试剂盒     10次
G&VS10311    动物腮腺组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10312    动物垂体组织细胞分离培养试剂盒     10次
G&VS10313    动物前列腺组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10314    动物生殖组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10315    动物鳞片（Scales）组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10316    动物皮肤组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10317    动物脾脏组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10318    动物胸腺组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10319    动物甲状腺组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10320    动物扁桃腺组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10321    动物肿瘤组织细胞分离培养试剂盒    10次
G&VS10341    人体NK细胞分离试剂盒        10次