动物组织肌质网横小管（T Tubules）粗提分离试剂盒产品说明书

主要用途
动物组织肌质网横小管（T Tubules）粗提分离试剂是一种旨在从动物肌肉组织中分离出完整而纯化的横小管组分的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种动物肌肉组织（人体、老鼠、兔子等的心脏、骨骼肌）的肌质网横小管的制备。可以被用于肌肉收缩机制、信号传递、钙离子通道、蛋白组学和细胞生理学等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度俱佳。

技术背景
心肌和骨骼肌的肌质网（sarcoplasmic reticulum；SR）细胞器组分是由两种特征性的膜结构系统组成：来自于内质网的纵小池（longitudinal cisternae）和包括三连体（triad）、肌纤维膜管性内褶形成的横小管（T tubules）。横小管膜分成游离部分和接合点部分。横小管的功能在于实施肌纤维内侧的动作电位（action potential），由此刺激-收缩偶联（excitation-contraction coupling）的信号经过三联体接合点（junction），传导到中端小池（terminal cisternae），触发钙离子释放，而产生肌肉收缩。横小管成为膜去极化（depolarization）信号通路启动的地方。其含有各种蛋白，包括磷脂酰肌醇（phosphoinositide）通路的磷脂酶C（phospholipase C）、G蛋白、蛋白激酶C（protein kinase C）、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate）；离子通道的L型钙离子通道、钠钾ATP酶通道；各种受体，例如β-肾上腺素受体、胰岛素受体等。横小管具有高度可塑性（plasticity），提供肌肉收缩的稳定性、以及肌肉损伤的修复机制，同时可以维持水平衡和肌质网钙存储、肌疲劳恢复、和葡萄糖转运调节等作用。横小管的分离是现代细胞生物学研究的常用手段之一：第一，通过机械或化学方法破裂组织细胞；第二，通过差速离心获得膜性组分；第三，通过等密度离心获得丰富密集的横小管；第四，通过麦胚凝集素（wheat germ agglutinin；WGA）获得高纯的横小管。
 
产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
裂解液（Reagent B）        毫升
净化液（Reagent C）        毫升
沉淀液（Reagent D）    毫升
强化液（Reagent E）        毫升
重悬液（Reagent F）        毫升
高纯液A（Reagent G）    毫升
高纯液B（Reagent H）    毫升
高纯液C（Reagent I）    毫升
保存液（Reagent J）        毫升
产品说明书        1份                                                
保存方式
保存裂解液（Reagent B）和强化液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
2毫升离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
4℃台式离心机：用于样品操作
4℃超速离心机：用于样品操作
DOUNCE匀浆器：用于裂解组织

实验步骤
1．手术取出动物组织，去除脂肪组织和肌筋组织，秤重以确定3克组织重量
2．（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4．即刻用刀片切碎组织
5．放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6．加入预冷的xx毫升裂解液（Reagent B）
7．涡旋震荡5秒，充分混匀
8．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
9．在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项5）
10．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
11．放进4℃台式离心机离心20分钟，速度为12000g
12．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒
13．加入xx毫升裂解液（Reagent B）
14．涡旋震荡5秒，充分混匀
15．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
16．在冰槽里用匀浆棒匀化颗粒（约80下）
17．将所有颗粒匀浆物移入15毫升锥形离心管
18．放进4℃台式离心机离心20分钟，速度为12000g
19．小心移出8毫升上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
20．加入xx微升预冷的净化液（Reagent C），混匀
21．放进4℃摇床孵育1小时，速度为100RPM
22．放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为150000g
23．小心抽去上清液
24．加入xx毫升预冷的沉淀液（Reagent D），混匀
25．室温下，放进摇床孵育20分钟，速度为100RPM
26．期间孵育5分钟、10分钟和15分钟时间点分别加入xx微升强化液（Reagent E）
27．放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为150000g
28．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒
29．加入xx毫升重悬液（Reagent F），充分混匀沉淀物
30．准备一个8毫升超速离心管
31．移取xx毫升的高纯液A（Reagent G）到8毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液A(Reagent G)）
32．移取xx毫升的高纯液B（Reagent H）在高纯液A（Reagent G）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液B(Reagent H)）
33．移取xx毫升的高纯液C（Reagent I）在高纯液B（Reagent H）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液C(Reagent I)）
34．轻轻加入xx毫升样品混匀液在高纯液C（Reagent I）的上面，避免震动
35．放进4℃超速离心机离心12小时，速度为77000g
36．小心取出超速离心管：可见顶端样品带
37．小心收集横小管样品带到2毫升离心管——此步骤获得横小管样品
38．加入xx至xx毫升保存液（Reagent J）
39．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为150000g
40．小心抽去上清液
41．加入xx微升保存液（Reagent J），混匀
42．放进－70℃冰箱里保存

注意事项
1．本产品为10次（3克动物组织/次）操作
2．所有操作均须在4℃或以下状态进行
3．操作时，须戴手套
4．操作时，须无菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）、重悬液（Reagent F）、高纯液A/B/C（Reagent G/H/I）和保存液（Reagent J）
5．建议使用足够的样品量
6．建议严格控制操作时间
7．通常匀化次数为80下达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
8．通常1克动物组织的横小管含量为150微克蛋白
9．本产品所获得的横小管的纯度和产量最为理想
10．如果需要获得95％以上纯度的横小管，建议使用肌质网横小管（T Tube）高纯分离试剂盒－G&VS10066.4.2
11．本公司提供系列肌质网分析试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定分离的横小管维持正常活性
3．本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                规格        
G&VS10066.4.1    动物组织肌质网横小管粗提分离试剂盒    10次
G&VS10066.4.1A    清理液（Reagent A）            毫升
G&VS10066.4.1B    裂解液（Reagent B）            毫升
G&VS10066.4.1C    净化液（Reagent C）            毫升
G&VS10066.4.1D    沉淀液（Reagent D）        毫升
G&VS10066.4.1E    强化液（Reagent E）            毫升
G&VS10066.4.1F     重悬液（Reagent F）            毫升
G&VS10066.4.1G     高纯液A（Reagent G）        毫升
G&VS10066.4.1H     高纯液B（Reagent H）        毫升
G&VS10066.4.1I     高纯液C（Reagent I）        毫升
G&VS10066.4.1J     保存液（Reagent J）            毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                    规格
G&VS10066.1    动物组织肌质网粗提分离试剂盒            10次
G&VS10066.2    动物组织活性肌质网分离试剂盒            10次
G&VS10066.3    动物组织高质纯化肌质网分离试剂盒        10次
G&VS10066.4.1    动物组织肌质网横小管（T Tubules）粗提分离试剂盒    10次
G&VS10066.4.2    动物组织肌质网横小管（T Tubules）高纯分离试剂盒    10次
G&VS10066.5    动物组织肌质网三联体（TRIAD）分离试剂盒        10次