细胞分泌型碱性磷酸酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
细胞分泌型碱性磷酸酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物对硝基苯磷酸受到分泌型碱性磷酸酶的水解，产生有色产物，在分光光度仪下，呈现吸光值的变化，即采用比色法定量测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。常用于分子生物学报告基因系统的评价。其适用于细胞培养上清以及动物血清中分泌型碱性磷酸酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
碱性磷酸酶（Alkaline Phophatase；ALP或ALKP；EC3.1.3.1），是一种在碱性环境下，水解并移去各种类型分子中的磷酸基团的酶蛋白。存在于所有人体组织以及其它生物体。动物碱性磷酸酶有四种不同的分别来自于小肠/胎盘/骨组织、肝组织和肾组织的同功酶。分子生物学实验中，常使用虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase；SAP）、牛小肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase；CIP）、胎盘碱性磷酸酶（placental alkaline phosphatase；PALP）和分泌型碱性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase；SEAP）。其中分泌型碱性磷酸酶是截断型（trancated），且膜结合性胎盘碱性磷酸酶，常用于报告基因（reported gene），检测转染后的真核细胞或组织启动子的活性以及基因表达水平。基于在镁离子的促进作用下，分泌型碱性磷酸酶催化水解底物对硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate；PNPP），释放出对硝基苯酚（p-nitrophenol）和磷酸（phosphate），通过分光光度仪检测对硝基苯酚（405nm），来定量测定分泌型碱性磷酸酶的活性。其反应系统为：
                                    

产品内容
缓冲液（Reagent A）     毫升
反应液（Reagent B）     毫升
产品说明书        1份

保存方式
保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent B）避免光照；有效保证3月；一旦打开使用，有效保证1至2月

用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
（微型）台式离心机：用于样品制备
比色皿或96孔板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤
一、样品准备
选择一：细胞培养基样品
1．移取1毫升待测转染细胞的培养基到1.5毫升离心管
2．放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1500g
3．移取上清液到新的1.5毫升离心管
4．放进65℃恒温水槽孵育15分钟（注意：去除内源性碱性磷酸酶干扰）
5．（选择步骤）移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
6．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

选择二：血清样品
1.准备好不含抗凝剂的抗凝管里
2.抽取1毫升血液，置于抗凝管里
3.室温下，静置30分钟，直至血液凝结
4.放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
5.小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）
6.放进65℃恒温水槽孵育15分钟（注意：去除内源性碱性磷酸酶干扰）
7.（选择步骤）移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
8.即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测读准备
1．开启分光光度仪预热
2．设定好分光光度仪：温度37℃，波长405nm，间隔60秒，测读6次（共5分钟），并置零
3．缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

三、背景对照测定
1.移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2.（选择步骤）即刻放进分光光度仪置零
3.（选择步骤）取出比色皿
4.加入xx微升反应液（Reagent B）
5.即刻上下倾倒数次，混匀（5秒钟内）
6.即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（5分钟读数－0分钟读数）

四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2．加入20微升待测样品（注意：或总量20微克总蛋白）
3．上下倾倒数次，混匀
4．（选择步骤）即刻放进分光光度仪置零
5．（选择步骤）取出比色皿
6．加入xx微升反应液（Reagent B）
7．即刻上下倾倒数次，混匀（5秒钟内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5分钟读数－0分钟读数）   

五、计算样品活性
 
六、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取xx微升缓冲液（Reagent A）到96孔板中
3．分别加入xx微升缓冲液（Reagent A）或待测样品（或10微克总蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
4．分别加入xx微升反应液（Reagent B）
5．轻轻摇动96孔板
6．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
7．活性计算

注意事项
1．本产品为20次（比色皿）或80次（96孔板）操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．样品避免使用磷酸盐缓冲溶液等处理
4．分光光度仪波长设置在405nm至410nm
5．系统操作过程中，背景测定只需1次
6．加入反应液（Reagent B）后5秒内进行比色测定
7．比色测定后，比色皿须清洗彻底
8．样本测定吸光读数升高表明具有酶活性
9．样品测定可以持续5分钟；计算活性时，可以选择其中单位时间（1分钟）的线性最大吸光读数差值作为样本读数
10．碱性磷酸酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 9.8的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1微摩尔对硝基苯磷酸
11．建议待测样本总蛋白浓度为10至20微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒G&VS30030.1）
12．胆红素（Bilirubin）、脂类（lipid）、葡萄糖（glucose）、抗坏血酸（ascorbic acid）和EDTA将干扰测定
13．本公司提供系列磷酸化酶学检测试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
编号        名称                    规格        
G&VS10065.3    细胞分泌型碱性磷酸酶活性比色法定量检测试剂盒    20次        
G&VS10065.3A    缓冲液（Reagent A）                100毫升
G&VS10065.3B     反应液（Reagent B）                50毫升
G&VS30030.1    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒            100次
产品编号        名称                    规格
G&VS10065.1    细胞分泌型碱性磷酸酶活性荧光定量检测试剂盒    20次
G&VS10065.2    细胞分泌型碱性磷酸酶活性化学发光法定量检测试剂盒    20次
G&VS10065.3    细胞分泌型碱性磷酸酶活性比色法定量检测试剂盒    20次