动物血小板高质纯化线粒体分离试剂盒产品说明书

主要用途
动物血小板高质纯化线粒体分离试剂是一种旨在通过低速差速离心和化学渗压休克处理来纯化血小板、以及物理或化学破膜和等密度离心的方法，直接从动物血细胞中分离出活性完整而高度纯化的血小板线粒体细胞器的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于人体和各种动物全血（鼠、猪、羊等）中血小板活性线粒体的制备。其制备物产量高，活性保证，纯度可达99％。可以被用于线粒体酶活性、细胞凋亡、衰老、信号传递、能量代谢、蛋白组学和古生物学、病理生理学（神经病变或肿瘤）等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度保证。
 
技术背景
线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：第一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。

产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
裂解液（Reagent B）        毫升
净化液（Reagent C）        毫升
强化液（Reagent D）    毫升
保存液（Reagent E）        毫升
活性液（Reagent F）        微升
高纯液（Reagent G）    毫升
产品说明书        1份                                             
保存方式
保存净化液（Reagent C）和活性液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；高纯液（Reagent G），避免光照；裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）严格无菌操作；有效保证6月

用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
4℃台式离心机：用于样品操作
4℃超速离心机：用于样品操作
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
超声仪：用于裂解细胞

实验步骤
一、物理处理法
实验开始前，将试剂盒里的活性液（Reagent F）冻融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 xx毫升净化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。
1．准备1个无菌的50毫升锥形离心管
2．轻轻混匀10至20毫升新鲜（2小时内抽取的静脉血）的抗凝全血样品
3．移入到50毫升锥形离心管
4．放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
5．小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群
6．用手指轻弹离心管2至3下，使细胞颗粒群松动
7．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
8．放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
9．小心移取上清液合并到上述50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）
10．放入含有上清液的离心管到台式离心机离心15分钟，速度为200g
11．小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）――此步骤获得血小板富集血清
12．放入含有上清液的离心管到台式离心机离心20分钟，速度为2000g
13．小心抽掉上清液
14．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
15．放入台式离心机离心20分钟，速度为2000g
16．小心抽去上清液（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）――此步骤获得纯化的血小板
17．加入xx毫升预冷的裂解工作液
18．涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
19．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约10下）（注意：参见注意事项11）
20．将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
21．（选择步骤）置于超声仪枪头下，离心管在冰槽里
22．（选择步骤）超声功率为60％（或150赫兹）猝击10秒，间隙30秒，10个循环
23．放进4℃台式离心机离心20分钟，速度为2000g
24．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除未溶解的细胞
25．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
26．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
27．加入xx微升保存液（Reagent E），充分混匀沉淀颗粒
28．放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
29．移取xx毫升的高纯液（Reagent G）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent G)）
30．轻轻加入xx微升线粒体混匀液在高纯液（Reagent G）的上面，避免震动
31．放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
32．小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
33．小心抽去线粒体样品带以上的液体
34．小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品
35．加入xx至xx毫升保存液（Reagent E）
36．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
37．小心抽去上清液
38．（选择步骤）重复实验步骤35至38一次
39．加入xx微升保存液（Reagent E），混匀
40．即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
41．放进－70℃冰箱里保存

二、化学处理法
实验开始前，将试剂盒里的活性液（Reagent F）冻融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 xx毫升净化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。
1．准备1个无菌的50毫升锥形离心管
2．轻轻混匀10至20毫升新鲜（2小时内抽取的静脉血）的抗凝全血样品
3．移入到50毫升锥形离心管
4．放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
5．小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群
6．用手指轻弹离心管2至3下，使细胞颗粒群松动
7．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
8．放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
9．小心移取上清液合并到上述50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）
10．放入含有上清液的离心管到台式离心机离心15分钟，速度为200g
11．小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）――此步骤获得血小板富集血清
12．放入含有上清液的离心管到台式离心机离心20分钟，速度为2000g
13．小心抽掉上清液
14．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
15．放入台式离心机离心20分钟，速度为2000g
16．小心抽去上清液（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）――此步骤获得纯化的血小板
17．入xx毫升预冷的裂解工作液
18．涡旋震荡5秒，充分混匀
19．在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
20．加入xx微升预冷的强化液（Reagent D）
21．涡旋震荡5秒，充分混匀
22．在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项11）
23．加入xx毫升预冷的保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
24．放进4℃台式离心机离心20分钟，速度为2000g
25．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除未溶解的细胞
26．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
27．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
28．加入xx微升保存液（Reagent E），充分混匀沉淀颗粒
29．放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
30．移取xx毫升的高纯液（Reagent G）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent G)）
31．轻轻加入xx微升线粒体混匀液在高纯液（Reagent G）的上面，避免震动
32．放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
33．小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
34．小心抽去线粒体样品带以上的液体
35．小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品
36．加入xx至xx毫升保存液（Reagent E）
37．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
38．小心抽去上清液
39．（选择步骤）重复实验步骤36至38一次
40．加入xx微升保存液（Reagent E），混匀
41．即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
42．放进－70℃冰箱里保存

注意事项
1．本产品为10次（10至20毫升全血/次）操作
2．其它实际操作的全血容量与试剂使用量按比例调整：例如40毫升全血，试剂用量加倍
3．操作时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
4．操作时，须戴手套
5．建议使用新鲜全血：2小时内的全血为理想状态，不要超过24小时
6．全血样品采集须使用EDTA二钾血液抗凝液（G&VS12059.1）、ACD血液抗凝液（G&VS12059.4），或肝素钠血液抗凝液（G&VS12059.5）
7．建议使用足够的样品量
8．血小板提取量因人而异；如果不足，建议增加全血量
9．线粒体操作均须在4℃或以下状态下进行
10．建议严格控制操作时间
11．物理处理法是优先推荐的技术处理
12．本产品所获得的线粒体纯度（可达到99％）和产量最为理想
13．使用高纯液（Reagent G）前，须摇匀后加入；并注意避免污染母液
14．根据超速离心管的大小调整高纯液（Reagent G）的使用量或在样品上面加上石蜡油填满
15．每毫升全血平均可获得2 X 108血小板
16．通常10毫升全血的血小板线粒体含量为10至25微克线粒体蛋白
17．如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解
18．线粒体正常活性测定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等
19．线粒体内外膜完整测定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和荧光JC染色
20．本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等
21．本公司提供系列线粒体试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定分离的线粒体内外膜完整
3．本产品经鉴定分离的线粒体维持正常活性
4．本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                规格        
G&VS10062.3    动物血小板高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10062.3A    清理液（Reagent A）            毫升
G&VS10062.3B    裂解液（Reagent B）            毫升
G&VS10062.3C    净化液（Reagent C）            毫升
G&VS10062.3D    强化液（Reagent D）        毫升
G&VS10062.3E    保存液（Reagent E）            毫升
G&VS10062.3F    活性液（Reagent F）            毫升
G&VS10062.3G    高纯液（Reagent G）        毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                规格
G&VS10006.1    动物细胞/组织线粒体粗提分离试剂盒    10/50次
G&VS10006.2    动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒    10/50次
G&VS10006.3    动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10006.4.1    动物硬组织线粒体粗提分离试剂盒    50次
G&VS10006.4.2    动物硬组织活性线粒体分离试剂盒    50次
G&VS10006.4.3    动物硬组织高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10018    纯化线粒体溶解试剂盒        20次
G&VS10047    非突触体脑组织线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10048.1    植物线粒体粗提分离试剂盒        10次
G&VS10048.2    植物活性线粒体分离试剂盒        10次
G&VS10048.3    植物高质纯化线粒体分离试剂盒        10次
G&VS10049.1    真菌/酵母细胞线粒体粗提分离试剂盒    10次
G&VS10049.2    真菌/酵母细胞活性线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10049.3    真菌/酵母细胞高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10059    纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂盒    20次
G&VS10062.1    动物血小板线粒体粗提分离试剂盒    10次
G&VS10062.2    动物血小板活性线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10062.3    动物血小板高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS30034.1    纯化线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.2    细胞/组织线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.3    真菌/酵母细胞线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.4    植物线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.5    全血线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.6    动物血小板线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS10063.1    海洋动物（虾贝类）线粒体粗提分离试剂盒    10/50次
G&VS10063.2    海洋动物（虾贝类）活性线粒体分离试剂盒    10/50次
G&VS10063.3    海洋动物（虾贝类）高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS12198    纯化线粒体冻存液            50毫升