海洋动物虾贝类组织高质纯化线粒体分离试剂盒产品说明书

主要用途
海洋动物虾贝类组织高质纯化线粒体分离试剂是一种旨在从海洋动物虾贝类软体组织中分离出完整而纯化的线粒体细胞器的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种海洋动物软体组织的活性线粒体的制备。其制备物产量高，活性保证，纯度可达99％。可以被用于细胞凋亡、信号传递、能量代谢、蛋白组学和病理生理学等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度堪称同类产品最佳。

技术背景
线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：第一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。线粒体的核酸遗传物质，具有进化速度快、非重组变异和母系遗传等特点，已成为最广泛使用的分子系统学标记之一， 已广泛应用于海洋动物学，尤其是虾贝类的分类学、群体遗传学和近缘种间系统发育研究。

产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
裂解液（Reagent B）        毫升
净化液（Reagent C）        毫升
酶解液（Reagent D）    毫升
保存液（Reagent E）        毫升
活性液（Reagent F）        微升
高纯液（Reagent G）    毫升
产品说明书        1份                                         
保存方式
保存净化液（Reagent C）、酶解液（Reagent D）和活性液（Reagent F）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备
15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备物的存放
50毫升锥形离心管：用于组织收集后离心或清洗
1.5毫升离心管：用于保存线粒体
4℃台式离心机：用于沉淀组织细胞
4℃超速离心机：用于分离细胞器成分
DOUNCE匀浆器：用于裂解组织

实验步骤
一、软体组织线粒体分离
实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）和活性液（Reagent F）冻融，然后移取xx微升活性液（Reagent F）、 xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1．取出待测动物组织，并秤重1克组织重量  
2．（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗
4．（选择步骤）小心抽去清洗液
5．移入到一个液氮冻存管
6．即刻放进液氮罐过夜
7．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
8．放进一个15毫升锥形离心管
9．加入xx毫升预冷的裂解工作液
10．涡旋震荡5秒，充分混匀
11．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
12．在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项7）
13．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
14．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
15．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
16．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
17．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
18．加入xx微升保存液（Reagent E），充分混匀
19．放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
20．移取xx毫升的高纯液（Reagent G）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent G)）
21．轻轻加入xx微升线粒体混匀液在高纯液（Reagent G）的上面，避免震动
22．放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
23．小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
24．小心抽去线粒体样品带以上的液体
25．小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品
26．加入xx至xx毫升保存液（Reagent E）
27．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
28．小心抽去上清液
29．（选择步骤）重复实验步骤26至28一次
30．加入xx微升保存液（Reagent E），混匀
31．即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
32．放进－70℃冰箱里保存

二、软体肌肉组织线粒体分离
实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）和活性液（Reagent F）冻融，然后移取xx微升活性液（Reagent F）、 xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1．取出待测动物组织，并秤重1克组织重量  
2．（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗
4．（选择步骤）小心抽去清洗液
5．移入到一个液氮冻存管
6．即刻放进液氮罐过夜
7．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
8．放进一个15毫升锥形离心管
9．加入预冷的xx毫升酶解液（Reagent D），充分混匀
10．放进冰槽里孵育3分钟
11．放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
12．小心抽去上清液
13．加入预冷的xx毫升清理液（Reagent A）和xx毫升 净化液（Reagent C），充分混匀
14．放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
15．小心抽去上清液
16．加入xx毫升预冷的裂解工作液
17．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
18．在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项7）
19．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
20．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
21．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
22．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
23．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
24．加入xx微升保存液（Reagent E），充分混匀
25．放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
26．移取xx毫升的高纯液（Reagent G）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent G)）
27．轻轻加入xx微升线粒体混匀液在高纯液（Reagent G）的上面，避免震动
28．放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
29．小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
30．小心抽去线粒体样品带以上的液体
31．小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品
32．加入xx至xx毫升保存液（Reagent E）
33．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
34．小心抽去上清液
35．（选择步骤）重复实验步骤32至34一次
36．加入xx微升保存液（Reagent E），混匀
37．即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
38．放进－70℃冰箱里保存

注意事项
1．本产品为10次（1克动物组织）操作
2．所有操作均须严格在4℃或以下状态进行
3．操作时，须戴手套
4．操作时，须无菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
5．建议使用足够的样品量
6．建议严格控制操作时间
7．通常匀化次数为80下达到80％的组织细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
8．通常1克动物组织的线粒体含量为50微克线粒体蛋白；但海洋动物的线粒体含量较低，平均每个细胞含有2000个线粒体不等
9．如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解
10．建议使用40000g以上离心速度；如果没有条件，则不能低于30000g，离心时间增加为60至90分钟
11．通常1克动物组织或5 X 107细胞的线粒体含量为50微克以上线粒体蛋白
12．如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解
13．本产品所获得的线粒体纯度（可达到99％）和产量最为理想
14．使用高纯液（Reagent G）前，须摇匀后加入；并注意避免污染母液
15．根据超速离心管的大小调整高纯液（Reagent G）的使用量或在样品上面加上石蜡油填满
16．线粒体正常活性测定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等
17．线粒体内外膜完整测定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和荧光JC染色
18．本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等
19．本公司提供系列线粒体分析试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定分离的线粒体内外膜完整
3．本产品经鉴定分离的线粒体维持正常活性
4．本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶
5．本产品经鉴定分离的线粒体纯度达99％

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号            名称                规格        
G&VS10063.3    海洋动物虾贝类组织高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10063.3A    清理液（Reagent A）                毫升
G&VS10063.3B    裂解液（Reagent B）                毫升
G&VS10063.3C    净化液（Reagent C）                毫升
G&VS10063.3D    酶解液（Reagent D）            毫升
G&VS10063.3E    保存液（Reagent E）                毫升
G&VS10063.3F    活性液（Reagent F）                毫升
G&VS10063.3G    高纯液（Reagent G）            毫升

试剂盒订购信息
产品编号            名称            规格
G&VS10006.1    动物细胞/组织线粒体粗提分离试剂盒    10/50次
G&VS10006.2    动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒    10/50次
G&VS10006.3    动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10006.4.1    动物硬组织线粒体粗提分离试剂盒    50次
G&VS10006.4.2    动物硬组织活性线粒体分离试剂盒    50次
G&VS10006.4.3    动物硬组织高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10018    纯化线粒体溶解试剂盒        20次
G&VS10047    非突触体脑组织线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10048.1    植物线粒体粗提分离试剂盒        10次
G&VS10048.2    植物活性线粒体分离试剂盒        10次
G&VS10048.3    植物高质纯化线粒体分离试剂盒        10次
G&VS10049.1    真菌/酵母细胞线粒体粗提分离试剂盒    10次
G&VS10049.2    真菌/酵母细胞活性线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10049.3    真菌/酵母细胞高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10059    纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂盒    20次
G&VS10062.1    动物血小板线粒体粗提分离试剂盒    10次
G&VS10062.2    动物血小板活性线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10062.3    动物血小板高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS30034.1    纯化线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.2    细胞/组织线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.3    真菌/酵母细胞线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.4    植物线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.5    全血线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.6    动物血小板线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS10063.1    海洋动物（虾贝类）线粒体粗提分离试剂盒    10/50次
G&VS10063.2    海洋动物（虾贝类）活性线粒体分离试剂盒    10/50次
G&VS10063.3    海洋动物（虾贝类）高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS12198    纯化线粒体冻存液            50毫升