细胞氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性同位素定量检测试剂盒产品说明书
 
主要用途
细胞氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性同位素定量检测试剂是一种旨在使用同位素碳14标记氯霉素，在氯霉素乙酰基转移酶的作用下，产生乙酰氯霉素，经有机溶剂萃取后，由同位素闪烁仪检测，即采用同位素法定量测定细胞裂解悬液制备样品中氯霉素乙酰基转移酶活性，藉此建立一种简单的定量评价报告基因的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于转基因后的活体细胞外源性氯霉素乙酰基转移酶活性分析。产品即到即用，性能稳定，参数优化，操作简便。
 
技术背景
氯霉素乙酰基转移酶（chloroamphenicol acetyltransferase； CAT）为细菌氯霉素抗性基因，通过乙酰化氯霉素上一个或两个羟基基团，使之失活。氯霉素乙酰基转移酶基因也是目前常用的哺乳动物基因表达的报告基因，用于分析转染后动物或植物细胞转录元素或启动子表达的水平状况。基于同位素碳14标记氯霉素底物，在氯霉素乙酰基转移酶的作用下，产生乙酰氯霉素，经有机溶剂萃取后，由同位素液体闪烁仪（liquid scintillation counter）检测，来测定氯霉素乙酰基转移酶的活性。
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产品内容
清理液（Reagent A）      毫升
裂解液（Reagent B）        毫升    
缓冲液（Reagent C）        毫升
反应液（Reagent D）    微升
阴性液（Reagent E）        微升
终止液（Reagent F）        毫升
产品说明书         1份

保存方式
保存反应液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；终止液（Reagent F）具有挥发性，注意密闭瓶盖；有效保证6月

用户自备
14C同位素标记氯霉素：用于样品反应
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
超声仪：用于裂解细胞
（微型）台式离心机：用于样品操作
测试管：用于同位素检测的容器
恒温水槽或培养箱：用于反应物孵育
闪烁液：用于同位素分析的介质
液体闪烁仪：用于同位素分析

实验步骤
一、样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于超声仪下超声处理：200瓦，50%功率，10秒一次，间隙1分钟，重复3次（注意：冰上操作）
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取200微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．（选择步骤）放进60℃恒温水槽孵育10分钟
16．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
17．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、活性检测
1．移取20微升上述制备的细胞裂解悬液（100微克总量蛋白）到新的1.5毫升离心管，标记为：待测样品管
2．移取xx微升阴性液（Reagent E）到新的1.5毫升离心管，标记为：背景管
3．分别加入xx微升缓冲液（Reagent C）到所有管里
4．分别加入1微升用户自备的14C同位素标记氯霉素（0.2mCi/毫升或200mCi/毫摩尔）到所有管里
5．分别加入xx微升反应液（Reagent D）到所有管里
6．涡旋震荡，混匀
7．放进37℃恒温水槽孵育1小时（可以孵育20小时）
8．分别加入xx微升终止液（Reagent F）到所有管里
9．涡旋震荡30秒
10．放进4℃微型台式离心机离心3分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
11．分别小心移取150微升上层液相到液体闪烁仪试管里
12．分别加入5毫升闪烁液
13．即刻放进液体闪烁仪（liquid scintillation counter）检测，记录背景和待测样品单位时间读数CPM

三、计算样品活性
注意事项
1．本产品为20次操作
2．同位素操作，严格执行安全操作规程
3．操作时，须戴手套
4．终止液（Reagent F）具有挥发性，注意密闭瓶盖
5．用户需要测定细胞裂解悬液的蛋白浓度，便于计算活性单位之需；建议使用 Bradford蛋白质浓度定量检测试剂盒（G&VS30030.1）
6．反应孵育时间的范围为30分钟至20小时分钟内；通常为1小时至3小时为佳
7．样品CPM读数高于背景CPM读数，表明具有酶活性
8．氯霉素乙酰基转移酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，每单位酶在单位时间内（每分钟）增加1CPM读数
9．本公司提供系列氯霉素乙酰基转移酶检测试剂产品

质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号            名称                    规格    
G&VS10064.1.1    细胞氯霉素乙酰基转移酶报告基因活性同位素定量检测试剂盒    20次
G&VS10064.1.1A    清理液（Reagent A）                  毫升
G&VS10064.1.1B    裂解液（Reagent B）                    毫升
G&VS10064.1.1C    缓冲液（Reagent C）                    毫升
G&VS10064.1.1D    反应液（Reagent D）                毫升
G&VS10064.1.1E    阴性液（Reagent D）                毫升
G&VS10064.1.1F    终止液（Reagent E）                    毫升

试剂盒订购信息
产品编号            名称                    规格
G&VS10064.1.1    细胞氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性同位素定量检测试剂盒    20次
G&VS10064.1.2    组织氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性同位素定量检测试剂盒    20次
G&VS10064.2.1    细胞氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性同位素薄层色谱（TLC）检测试剂盒    20次
G&VS10064.2.2    组织氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性同位素薄层色谱（TLC）检测试剂盒    20次
G&VS10190.1    细胞氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性荧光定量检测试剂盒    20次
G&VS10190.2    组织氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性荧光定量检测试剂盒    20次
G&VS10191.1    细胞氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性荧光薄层色谱（TLC）检测试剂盒    20次
G&VS10191.2    组织氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性荧光薄层色谱（TLC）检测试剂盒    20次
G&VS10553.1    细胞氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS10553.2    组织氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因活性比色法定量检测试剂盒    20次