CAT#:JW-220130-5
低温运输，-20℃保存

T3体外转录及加帽试剂盒

产品及特点
本试剂盒是基于沙门氏噬菌体T3 RNA聚合酶的RNA体外转录及加帽试剂盒，它利用含有T3启动子的模版DNA，以NTP和m7G(5' )ppp(5' )G为底物，从T3启动子下游开始合成与模板DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子（含带帽RNA）。本产品具有下列特点：
1.即开即用，用户只需提供含T3启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需单独准备每一个成份。
2.体外转录和加帽同管一步式进行，不需要先体外转录再加帽。
3.单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
4.模板DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
5.可以合成的RNA的最佳长度在20nt到5000nt之问。
6.产品配方经过精心优化，每μg DNA模板可以合成2-6μg RNA。
7.得到的加帽RNA比不加帽的RNA更稳定，可以用于RNA结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰（RNAi）等实验。

规格及成分
本产品使用五孔盒包装
成份                                                            编号       规格    包装
2×T3体外转录及加帽预配液                    220130a    50μL    0.1mL本盖管
T3 RNA聚合酶-RI混合液                         220130b    5μL     10μL红盖管
RNase-free水                                            980403    1mL    1mL蓝盖管
使用手册                                                220130sc    1份      无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
如果需要去除转录产物中的DNA模板，则需要RNase-free DNase、Tris饱和酚、氯仿、微量核酸沉淀剂、RNase-free 75%乙醇。

使用方法
一、制备DNA模板
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的DNA序列的上游必须有T3启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T3启动子序列（5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T3启动子的载体，并且克隆位点必须位于T3启动子下游。三是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3’突出。如果是3’突出（如选择了Pst I来线性化质粒），则最好用T4 DNA聚合酶修平。四是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。
二、体外转录及加帽反应
1.如果有N个样品，强烈建议做一个阴性对照，故共设置N+1个反应，这样一起并排电泳时容易判断哪个条带是模板DNA，哪个条带是扩增得到的RNA。在N+1个RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在4℃下）按次序加入下列成分：
成分                                            N个样品管                                               阴性对照
DNA模板           各50ng（PCR片段模板）或各1μg（质粒模板）    50ng（PCR片段）1μg（质粒DNA）
2×T3体外转录及加帽预配液                   10μL                                                10μL
T3 RNA聚合酶-RI混合液                        1μL                                                不加
RNase-free水                                  补水到20μL                                            补水到20μL
注：此为20μL反应体系的用量，对其他体积的反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要另购NTP与2×T3转录预配液分开提供的试剂盒。
2.37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3.70℃加热10分钟灭活T3 RNA聚合酶。
4.取1-3μL电泳检测转录效果。比阴性对照多出的条带就是扩增得到的RNA（由于检测时的电泳不需要碱变性胶，并且合成的RNA长度不一定均匀，即使长度均匀，但由于自生形成发夹结构，因此不一定呈现清晰的电泳条带。但由于RNA是单链，分子量比同样长度的DNA小一倍，因此转录得到的RNA一般比其模板电泳速度更快。
5.定量，可以用自备的单链RNA定量试剂盒检测浓度，也可以肉眼比较电泳胶上RNA和DNA的强度。由于RNA是单链，跟核酸染料结合力低，因此同等亮度的RNA条带，其RNA分子数一般比DNA的分子数多一倍。1μg DNA模板一般可以合成 2-6μg的RNA（含带帽RNA）。
6.得到的RNA可以放-80℃保存（溶液中有DNA模板和未使用的NTP）。
注：若需进一步去除T3转录反应体系中的DNA模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买，本试剂盒不提供。
1.在体外转录结束后，在反应体系中加入3-5 U自备的 RNase-free DNase。
2.37℃保温15-30分钟。
3.补水到100μL，
4.用自备的等体积（100μL）的Tris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5.在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂（CAT#50903；用前需要摇晃混匀），振荡后15000 rpm离心3-5分钟，弃上清。
6.加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后15000 rpm离心3-5分钟，弃上清。
7.短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8.晾干半分钟，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

答客问
1、没有RNA产物。最常见原因是DNA模板有RNase污染，测试方法是将纯化的有两条典型RNA条带的总RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。
2、RNA产量低。最常见的原因是DNA模板序列。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3、RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T3 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6或T7体外转录试剂盒（启动子也必须做相应的改变）。
4、RNA长度比预计的长。T3 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，模板又是质粒，则可能是质粒线性化不彻底。
5、5’单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T3 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5’端是单磷酸的比例将大大增加。

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