动物细胞 β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
动物细胞 β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂是一种旨在使用化学方法， 快速有效 地裂解动物细胞，通过高速离心，获得澄清细胞裂解悬液，在β-半乳糖苷酶反应体系里，以氯苯胺红 - β-D- 吡喃半乳糖苷为棕黄色底物， 水解所产生的暗红色的氯苯胺红， 即采用比色法定量测定细胞裂解悬 液制备样品中的低表达β-半乳糖苷酶活性， 藉此建立一种简单的定量评价报告基因的权威而经典的技术方 法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生 物学研究。其适用于转基因后的活体细胞外源性以及衰老细胞内源性半乳糖苷酶活性分析。产品即到即用， 性能稳定，参数优化，操作简便、高度敏感，堪称国际上同类产品最佳。

技术背景
大肠杆菌的标志基因Lac Z编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase  ；  β-gal) ，在其催化作用下， 半乳糖可从乳 糖的水解作用中得到。 β-半乳糖苷酶非常稳定，对蛋白水解降解作用抗性强，且容易测试。因此β-半乳糖 苷酶成为目前最常用的报告基因，以评价载体转染的效果。在衰老细胞内，显示β-半乳糖苷酶活性。氯苯 胺红 -β-D-  吡喃半乳糖苷(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside；CPRG)，是一种棕黄色底物， 以替代乳 糖，十倍强于邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷，在β-半乳糖苷酶的催化下，水解成无色的半乳糖和暗红色的氯苯 胺红，通过570nm波长的吸光值分析，来测定β-半乳糖苷酶的活性单位。

产品内容
清理液(Reagent A)    毫升
裂解液(Reagent B)    毫升
稀释液(Reagent C)    毫升
反应液(Reagent D)    毫升
终止液(Reagent E)    毫升
产品说明书    1 份

保存方式
保存  反应液(Reagent  D)在－70C冰箱里， 严格避免反复冻融； 其余的保存在 4C冰箱里； 反应液(Reagent D)避免光照；有效保证 2 月

用户自备
15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5 毫升离心管：用于样品操作的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
(微型)台式离心机：用于样品操作
比色皿或酶标板：用于比色检测的容器
恒温水槽或培养箱：用于反应物孵育
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤
实验开始前， 开启分光光度仪预热， 设置波长 570nm；开启恒温水槽， 设置温度为 37C。同时从－20C冰 箱里取出 裂解液(Reagent B) 和 反应液(Reagent D) 置于冰槽里融化； 反应液(Reagent D) 避免光照。然后进行下列操作：
一、  样品准备
1 ．  准备好 25cm2细胞培养瓶或 60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至 5 X 106细胞)
2 ．  小心加入 xx 毫升 清理液(Reagent A)，覆盖生长表面
3 ．  小心抽去清理液
4 ．  使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意： 可以使用胰酶消化)
5 ．  加入 xx 毫升 清理液(Reagent A)，混匀细胞
6 ．  移入到预冷的 15 毫升锥形离心管(注意： 悬浮细胞从这一步骤开始)
7 ．  放进 4C台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g
8 ．  小心抽去上清液
9 ．  加入 xx 微升 裂解液(Reagent B)，充分混匀
10．转移到预冷的 1.5 毫升离心管
11．强力涡旋震荡 15 秒
12．置于冰槽里孵育 30 分钟
13．放进 4C微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g  (或 13000RPM，例如 eppendorf 5415)
14．小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管
15．移取 10  微升进行蛋白定量检测(注意： 建议使用  Bradford  蛋白质浓度定量试剂盒－ G&VS30030.1)
16．即刻放进－70C保存或置于冰槽里继续后续操作

二、  活性检测
方法一：常规检测(比色皿)
1 ．  移取 100 微升上述制备的细胞裂解悬液样品到新的比色皿
2 ．  加入 xx 微升 稀释液(Reagent C)
3 ．  上下倾倒数次，混匀
4 ．  放进 37C恒温水槽孵育 5 分钟
5 ．  加入 xx 微升 反应液 (Reagent D) (注意： 使用前， 充分混匀 反应液(Reagent D) 中可能的沉淀)
6 ．  上下倾倒数次，混匀
7 ．  放进 37C恒温水槽孵育至少 30 分钟，直至出现暗红色(注意： 参见注意事项11  和12)
8 ．  加入 xx 微升 终止液(Reagent E)
9 ．  即刻放入分光光度仪检测，记录样品吸光读数， 理想读数为 0.1 至 1.2 范围内

方法二：微量检测(酶标板)
1.     移取 20 微升上述制备的细胞裂解悬液样品到酶标板中的 1 个孔里
2.     加入 xx 微升 稀释液(Reagent C)
3.     轻轻摇动酶标板数次，混匀
4.     放进 37C培养箱孵育 5 分钟
5.     加入 xx 微升 反应液(Reagent D) (注意： 使用前，充分混匀 反应液(Reagent D) 中可能的沉淀)
6.     轻轻摇动酶标板数次，混匀
7.     放进 37C培养箱孵育至少 30 分钟，直至出现暗红色(注意： 参见注意事项11  和12)
8.     加入 xx 微升 终止液(Reagent E)
9.     即刻放入分光光度仪检测，记录样品吸光读数， 理想读数为 0.1 至 1.2 范围内

三、  计算样品活性
计算一：按照操作步骤规定
1 ．  比色皿计算：
[样品读数 X x        ＝微摩尔 CPRG/分钟/毫升

2 ．酶标板计算： [样品读数 X      X 反应时间(分钟) ]＝微摩尔 CPRG/分钟/毫升

计算二：基本公式
[样品读数 X 样品稀释倍数 X 反应体积(毫升) ]÷[样品容量(毫升) X xx  (毫摩尔吸光系数) X  比色距径 (厘米) X 反应时间(分钟) ]＝微摩尔 CPRG/分钟/毫升
计算三：(微摩尔 CPRG/分钟/毫升) 换算成(微摩尔CPRG/分钟/毫克样品蛋白)
[实际活性值(微摩尔CPRG/分钟/毫升) ]÷实际样品蛋白浓度(毫克/毫升) ＝微摩尔CPRG/分钟/毫克样品 蛋白

注意事项
1 ．  本产品为 20 次(比色皿)和 80 次(酶标板)操作
2 ．  建议使用核内表达的载体代替胞内表达的载体转染或感染细胞
3 ．  本产品的各项参数达到最优化
4 ．  建议操作时，注意避光
5 ．  操作时，须戴手套
6 ．  反应液(Reagent D) 严格避免光照和反复冻融
7 ．  用户可以根据需求按比例调整试剂用量进行样品制备
8 ．  用户可以测定细胞裂解悬液的蛋白浓度， 便于计算活性单位之需； 建议使用 Bradford 蛋白质 浓度定量检测试剂盒(G&VS30030. 1)
9 ．  如果用户需要测定背景空对照，可以完全按照活性检测的操作步骤进行，唯一变化在于 100 微升样品 改成 xx 微升 裂解液(Reagent B) 替代
10．如果用户测得背景空对照，计算活性时，勿忘(样品吸光读数－背景空对照读数)
11．反应孵育时间的理想范围为 10 分钟至 30 分钟内出现暗红色显色：低于 5 分钟表明酶活性过高，建议稀释样品，否则影响检测精度
12．如果样品的酶活性过低，可以增加孵育时间至 72 小时
13．样品的酶活性吸光值在 0.1 至 1.2 OD 单位为理想状态， 其酶活性与吸光值成线性正相关； 吸光值在 0.3 至 0.9 OD 单位为完美状态
14．反应终止后，即刻进行比色测定
15．比色测定后，比色皿须清洗彻底
16．酶活性单位浓度定义： 在 37C温度下， 每单位酶在单位时间内(每分钟)水解 1 微摩尔的氯苯胺红 -β-D- 吡喃半乳糖苷
17．本公司提供系列 β-半乳糖苷酶检测试剂产品

质量标准
1 ．  本产品经鉴定性能稳定
2 ．  本产品经鉴定检测高度敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后， 应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证 说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式(实验报告) 与本公司联系，并将该产品退回， 经检验确系产品质量所致， 本公司负责更换产品。如系使用者错误操作 所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK ，  RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
编号        名称                        规格
G&VS10060. 1    动物细胞 β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS10060. 1A    清理液(Reagent A)    100 毫升
G&VS10060. 1B    裂解液(Reagent B)    10 毫升
G&VS10060. 1C    稀释液(Reagent C)    100 毫升
G&VS10060. 1D    反应液(Reagent D)    10 毫升
G&VS10060. 1E    终止液(Reagent E)    100 毫升
G&VS10060.2    动物组织 β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒    20 次
产品编号        名称                规格
G&VS10010. 1    细胞β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒    100/250 次
G&VS10010.2    全组织β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒    10 次
G&VS10010.3    冰冻切片β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒    50 次
G&VS10012. 1    细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒    100/250 次
G&VS10012.2    全组织衰老特异性细胞β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒    10 次
G&VS10012.3    冰冻切片衰老特异性细胞β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒    50 次
G&VS60003. 1    细菌β－半乳糖苷酶原位染色试剂盒    40 次
G&VS60003.2    细菌 β-半乳糖苷酶化学发光定量检测试剂盒    20 次
G&VS60003.3    细菌 β-半乳糖苷酶比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS60003.4    细菌 β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS10037. 1    动物细胞 β-半乳糖苷酶化学发光定量检测试剂盒    20 次
G&VS10037.2    动物细胞 β-半乳糖苷酶比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS10037.3    动物组织 β-半乳糖苷酶比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS60013. 1    真菌/酵母 β-半乳糖苷酶化学发光定量检测试剂盒    20 次
G&VS60013.2    真菌/酵母 β-半乳糖苷酶比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS60013.3    真菌/酵母细胞 β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS60013.4    真菌/酵母 β-半乳糖苷酶滤膜染色试剂盒    20 次
G&VS10060. 1    动物细胞 β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS10060.2    动物组织 β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS30030. 1    Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒    100 次
G&VS30030.2    Bradford 大量蛋白质浓度定量试剂盒    50 次
G&VS30031    BCA 蛋白质浓度定量试剂盒    100/500 次