纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂盒产品说明书

主要用途
纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂是一种旨在通过化学裂解处理，获得可溶性线粒体总蛋白，然后使用考马斯亮蓝染色剂G-250与可溶性蛋白质特异性结合产生色彩差异变化，通过比色测定其最大吸收转换来定量线粒体蛋白质浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种纯化线粒体（动物、人体、植物、昆虫等）的蛋白质浓度测定。用于后续蛋白一维或二维电泳、西方杂交、酶活测定等等。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
线粒体是细胞中重要的细胞器，其主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。线粒体中含有丰富的细胞色素氧化酶系统和细胞凋亡相关蛋白等。通过特殊裂解液，最大限度获得可溶性线粒体蛋白质。考马斯亮蓝染料G-250（Coomassie Brilliant Blue G-250）是一种与蛋白质结合的化学染料。它的三苯甲烷（triphenylmethane）基团，主要与蛋白质的非极性结构结合。而它的阴离子磺酸盐（anion sulfonate）基团与蛋白质分子的阳离子和芳香类氨基酸，尤其是精氨酸和赖氨酸侧链的结合。在酸性环境下，其最大吸收波长从465nm转换为595nm。Bradford提出的方法的最大优点在于不受样品中各种化学成分的干扰。

产品内容
裂解液（Reagent A）        毫升
反应液（Reagent B）     毫升
标准液（Reagent C）        微升
补充液（Reagent D）    毫升
产品说明书        1份

保存方式
保存标准液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，反应液（Reagent B），避免光照；有效保证3月

用户自备
动物细胞/组织线粒体粗提分离试剂盒（G&VS10006.1）：用于获得线粒体成分
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
（微型）台式离心机：用于沉淀不溶性物质
涡旋震荡仪：用于混匀
96孔板或比色皿：用于样品比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤
一、样品准备
1．从－70℃冰箱里取出线粒体颗粒样品，置入冰槽里融化
2．移取50微升线粒体悬液
3．加入xx微升（或150微升）裂解液（Reagent A）
4．涡旋震荡15秒
5．置入冰槽中孵育15分钟
6．涡旋震荡60秒
7．放进微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
8．小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统
9．置于冰槽里准备后续操作
10．若暂时不予后续处理，保存在－20℃冰箱里

二、蛋白定量
一、96孔板微量测定
A．建立标准样品曲线
1．将－20℃冰箱里试剂盒中的标准液（Reagent C）置入冰槽里融化
2．准备1个96孔板，做好相应的标记
3．按下表配制标准样品反应液
1）分别移取适量的标准液（Reagent C）到96孔板里指定序号的样品孔里
2）分别移取适量的补充液（Reagent D）到96孔板里指定序号的样品孔里
3）最后分别加入xx微升反应液（Reagent B）

序号   标准液（Reagent C）  补充液（Reagent D）  反应液(Reagent B)  标准样品蛋白质含量（微克）
1    xx微升        0        xx微升        10
2    xx微升        xx微升        xx微升        5
3    xx微升        xx微升        xx微升        2.5
4    xx微升        xx微升        xx微升        1.25
7    0        xx微升        xx微升        0
4．轻轻摇动96孔板，混匀反应物
5．室温下暗室里孵育5分钟
6．即刻放进酶标仪测定：波长为595nm
7．构建蛋白质浓度标准曲线：纵座标（Y）为吸光值OD595，横座标（X）为蛋白质含量（微克）
B．样品测定
1．移取10微升上述制备的待测样品到96孔板里指定序号的样品孔里
2．加入xx微升反应液（Reagent B）
3．轻轻摇动96孔板，混匀反应物
4．室温下暗室里孵育5分钟
5．即刻放进酶标仪测定：波长为595nm
6．根据上述标准曲线，测出待测样品的检测含量，再除以5微升（样品量），获得待测样品的实际浓度（微克/微升）（注意：参见注意事项5）

二、比色皿标准测定
A．建立标准样品曲线
1．将－20℃冰箱里试剂盒中的标准液（Reagent C）置入冰槽里融化
2．准备好1毫升比色皿
3．按下表配制标准样品反应液
1）分别移取适量的标准液（Reagent C）到1毫升比色皿
2）分别加入适量的补充液（Reagent D）
3）最后分别加入xx毫升反应液（Reagent B）
序号  标准液（Reagent C）  补充液（Reagent D）  反应液（Reagent B）  标准样品蛋白质含量（微克）
1    xx微升        0        xx毫升        25
2    xx微升        xx微升        xx毫升        12.5
3    xx微升        xx微升        xx毫升        6.25
4    xx微升        xx微升        xx毫升        3.125
5    0        xx微升        xx毫升        0
4．轻轻上下倾倒比色皿，混匀反应物
5．室温下暗室里孵育5分钟
6．即刻放进分光光度仪测定：波长为595nm
7．绘制蛋白质浓度标准曲线：纵座标（Y）为吸光值OD595，横座标（X）为蛋白质含量（微克）

B．样品测定
1．移取25微升上述制备的待测样品到1毫升比色皿里   
2．加入xx毫升反应液（Reagent B）
3．轻轻上下倾倒比色皿，混匀反应物
4．室温下暗室里孵育5分钟
5．即刻放进分光光度仪测定：波长为595nm
6．根据上述标准曲线，测出待测样品的检测含量，再除以12.5微升（样品量），获得待测样品的实际浓度（微克/微升）（注意：参见注意事项5）
 
注意事项
1．本产品为20次（比色皿）、100次（96孔板）样品操作
2．操作时须戴手套
3．整个操作过程须在4℃条件下进行
4．如果移取线粒体样品的液体容量为10微升，可加入90微升裂解液（Reagent A），以此类推，但在计算公式时，注意实际样品量的调整
5．样品浓度计算公式：
标准曲线求得蛋白含量（微克）÷实际样品量（微升）＝微克/微升
6．加样后即刻比色测定
7．比色测定后，比色杯须清洗彻底
8．下列化学成分和浓度范围不会干扰比色检测：
Acetate        0.6 M        KCI         1.0 M
Acetone                 Malic acid        0.2 M
Adenosine     1 mM         MgCl2        1.0 M
Amino Acids             Mercaptoethanol    1.0 M
Ammonium sulfate    1.0 M         MES        0.7 M
Ampholytes             Methanol        0.5％
Acid                 MOPS        0.2 M
ATP         1 mM         NaCl        5 M
Barbital                 NAD         1 mM
BES         2.5 M         NaSCN        3 M
Boric acid                 Peptones
Cacodylate-Tris     0.1 M         Phenol        5%
CDTA         0.05 M         Phosphate    1.0 M
Citrate         0.05 M         PIPES        0.5 M
Deoxycholate    0.1%         Polyadenylic acid    1 mM
Dithiothreitol     1 M         Polypeptides （MW<3000）
DNA         1 mg/ml         Pyrophosphate    0.2 M
EDTA         0.1 M         rRNA        0.25 mg/ml
EGTA,         0.05 M         tRNA        0.4 mg/ml
Ethanol                 total RNA        0.30 mg/ml
Eagle’s MEM             SDS         0.1%
Earle’s salt solution         Sodium phosphate
Formic acid     1.0 M         Streptomycin sulfate    20%
Fructose                 Triton X-100    0.1%
Glucose                 Tricine
Glutathione             Tyrosine         1 mM
Glycerol         99%         Thymidine     1 mM
Glycine        0.1 M         Tris        2.0 M
Guanidine-HCI             Urea        6 M
Hank's salt solution             Vitamins
HEPES buffer    0.1 M
9. 建立微量测定的标准曲线，建议使用的蛋白质浓度范围为0至10微克
10.本公司提供系列线粒体试剂产品

质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定无蛋白酶污染
3．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号            名称            规格
G&VS10059    纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂盒    20次
G&VS10059A    裂解液（Reagent A）            毫升
G&VS10059B    反应液（Reagent B）            毫升
G&VS10059C     标准液（Reagent C）            毫升
G&VS10059D     补充液（Reagent D）        毫升        

试剂盒订购信息
产品编号            名称            规格
G&VS10006.1    动物细胞/组织线粒体粗提分离试剂盒    10/50次
G&VS10006.2    动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒    10/50次
G&VS10006.3    动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10006.4.1    动物硬组织线粒体粗提分离试剂盒    50次
G&VS10006.4.2    动物硬组织活性线粒体分离试剂盒    50次
G&VS10006.4.3    动物硬组织高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10018    纯化线粒体溶解试剂盒    20次
G&VS10047    非突触体脑组织线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10048.1    植物线粒体粗提分离试剂盒    10次
G&VS10048.2    植物活性线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10048.3    植物高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10049.1    真菌/酵母细胞线粒体粗提分离试剂盒    10次
G&VS10049.2    真菌/酵母细胞活性线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10049.3    真菌/酵母细胞高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10059    纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂盒    20次
G&VS10062.1    动物血小板线粒体粗提分离试剂盒    10次
G&VS10062.2    动物血小板活性线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10062.3    动物血小板高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10099.1    动物全血线粒体粗提分离试剂盒    10次
G&VS10099.2    动物全血活性线粒体分离试剂盒    10次
G&VS10099.3    动物全血高质纯化线粒体分离试剂盒    10次
G&VS30034.1    纯化线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.2.1    动物硬组织线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.2.2    动物软组织线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.2.3    动物细胞线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.3    真菌/酵母细胞线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.4    植物线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.5    全血线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS30034.6    动物血小板线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次
G&VS10063.1    海洋动物（虾贝类）线粒体粗提分离试剂盒    10/50次
G&VS10063.2    海洋动物（虾贝类）活性线粒体分离试剂盒    10/50次
G&VS10063.3    海洋动物（虾贝类）高质纯化线粒体分离试剂盒    10次