CAT#:JW-211216
低温运输，-20℃保存

可调式易错PCR试剂盒

产品及特点
易错PCR（Error-prone PCR）是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性，在一定条件下（如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在）能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体。本产品是在本公司的易错PCR试剂盒的基础上改进而得，本产品具有下列特点：
1.即开即用，十分简单方便，尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2.配方经过精心优化，实验人员在一定范围内可以控制突变率，一轮PCR的突变率范围在2-8突变/1000bp，更高的突变率可以通过多轮PCR达到。
3.可用于连续易错PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
4.可以扩增的DNA片段更长，达到2kb，对于2kb以上的产物，建议分段扩增。
5.产物可用于TA克隆。
6.本试剂盒足够100次30uL体系的易错PCR。
7.本产品只能用于科研。
规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成份            编号    规格    包装
可调易错PCR专用
Taq DNA聚合酶（5U/uL）    101005    50 μL    0.5 mL红盖管
5×可调易错PCR Mix（含dNTP）    211216a    600 μL    0.5 mL黄盖管
可调易错PCR专用MnCl2    211216c    300 μL    0.5 mL紫盖管
可调易错PCR专用dGTP    211216d    300 μL    0.5 mL蓝盖管
10×可调易错PCR追加dNTP    211216e    300 μL    0.5 mL本色管
使用手册            211216sc    1份    无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期为一年。

自备试剂
引物、DNA模板、常规PCR试剂盒。

使用方法
1.将引物稀释到10μM。引物也是决定易错PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25-30nt之间，GC含量在45%-60%之间，3端GC含量低，并且没有发夹结构。
2.用自备易错PCR引物和自备的常规PCR试剂扩增制备易错DNA模板（常规PCR产物），胶回收并准确确定浓度。注意：易错PCR的模板一定要用胶回收的常规PCR产物，因为胶回收会可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用易错PCR引物扩增所得，在易错PCR扩增时也会被扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。
3.将回收的DNA片段（模板）稀释到1ng/μL、10ng/μL和100ng/μL三个浓度。注意：模板使用量是影响突变率的最重要因素，模板DNA为非突变DNA，扩增产生的DNA为突变DNA，易错PCR体系最终DNA量是基本固定的，因此模板DNA使用量越大，则突变DNA在终产物中的相对比例就越低，突变率就越低。故建议同时测试三个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的PCR产物进行分析。
4.根据每1000bp的预期突变数按下表确定30uL易错PCR体系中MnCl2和dGTP的用量（这是在模板DNA不超过1ng的前提下的数据）。表中的Mn表示可调易错PCR专用的MnCl2，dG表示可调易错PCR专用的dGTP：
预期突变数    2个    3个    4个    5个    6个    7个    8个
Mn用量（uL）    0    1.0    2.5    4.0    4.0    4.0    4.0
dG用量（uL）    0    0    0    1.0    2.0    3.0    4.0
5.设置30μL体系的可调易错PCR：第一次建议设置3个模板浓度。在3干净的PCR管中，分别加入下列成分。最后加可调易错PCR专用MnCl2：
成分        模板用量1            模板用量2        模板用量3
可调易错PCR Mix，5×    6 μL        6 μL        6 μL
可调易错PCR
专用dGTP        根据上步用量表表选择    根据上步用量表选择    根据上步用量表选择
自备DNA模板    1 μL（1ng/μL）        1 μL（10ng/μL）    1 μL（100ng/μL）
自备PCR引物
(10 μM each)    1 μL each            1 μL each        1 μL each
可调易错PCR专用
Taq DNA聚合酶    0.5 μL            0.5 μL        0.5 μL
可调易错PCR
专用MnCl2    根据上步用量表表选择    根据上步用量表表选择    根据上步用量表表选择
自备超纯水    补水到30 μL    补水到30 μL    补水到30 μL
6.按已经优化的常规PCR条件进行易错PCR：
PCR前变性            94℃ 3分钟
易错PCR(循环30-60次)    94℃ 1分钟
            60℃ 1分钟
            72℃ 3-10分钟
注：由于易错PCR含高浓度的镁离子，因此容易形成引物二聚体，因此需要使用较高的复性温度，以避免小片段扩增产物竞争性抑制PCR。易错PCR一般不需要热启动，也不需要在易错PCR结束后做延伸处理。易错PCR循环次数越多，突变DNA（扩增产物）与非突变DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的绝对数就越高，在同一模板上发生的突变位点数就越多，所以如果需要，可以做30、35、40、45、50、55、60次7个循环数的比较。
7.易错PCR结束后，取3μL进行电泳检查。
8.如果有预期大小的PCR产物，则全部电泳，进行胶回收，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的DNA为模板，再进行下一轮易错PCR。
9.如果没有预期大小的PCR产物，可以按下列操作追加进行一轮常规PCR（追加PCR）。
10.在PCR管中，加入3μL 10×可调易错PCR专用追加dNTP到27uL电泳剩下的PCR体系中，按下表进行追加PCR（chasing PCR）。注意追加PCR只做20次循环。
步骤    参数        循环数
追加PCR    94℃ 1分钟    循环20次
    60℃ 1分钟    
    72℃ 1分钟    
11.追加PCR结束后，再电泳检测。如果有条带，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的DNA为模板，再进行下一轮易错PCR。
12.如果没有预期大小的PCR产物，则需要分析原因。

疑难解答
Q：现象：没有PCR产物。
A：可能原因：一是引物没有优化，可以重新设计引物；二是模板DNA太少，可以增加用量；三是模板不纯，最好先胶回收；四是DNA溶液中有EDTA，可以适当补加Mg++。
Q：现象：太多的PCR条带或PCR条带模糊一片。
A：可能原因：一是模板有胶回收、二是PCR循环数太多；三是复性温度太低；四是引物没有优化；五是PCR条件没优化，可以使用touch-down PCR。
Q: 如果需要更高的突变率，如何办？
A: 可以使用连续多次易错PCR来提高突变率。但最好先用胶纯化回收易错PCR片段,再用于下一轮易错PCR。

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