CAT#:JW-211214-50
低温运输，-20℃保存

T7体外转录试剂盒

产品及特点
本试剂盒是基于T7 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有T7启动子的模版DNA，以NTP为底物，从T7启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。本产品具有下列特点：
1.即开即用，用户只需提供含T7启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需要单独准备每一个成份。
2.单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3.模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4.可以合成的RNA的最佳长度在20nt到2000 nt之间。
5.产品配方经过精心优化，每μg DNA模版可以合成2-6 μg RNA。
6.得到的RNA可以用于RNA结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和RNA干扰（RNAi）等实验。
7.本试剂盒足够50次20μL体系的体外转录实验。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
成份            编号    规格    包装
T7转录预配液，2×        211214a    0.5 mL    0.5mL绿色盖
T7 RNA聚合酶-RI混合液    211214b    50 μL    0.5mL红色盖
RNase-free水        980403    1 mL    1.5mL亮黄盖
使用手册            211214sc    1 份    无
本产品使用五孔盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存、有效期一年。

自备物品
Tris饱和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇(均可从本公司另购)

相关资料
一、制备DNA模板（本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考）
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。
1.必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
2.需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列（5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’）加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子下游。
3.需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3’突出。如果是3’突出（比如选择了Pst I来线性化质粒），则最好用T4 DNA聚合酶修平。
4.是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。如果有RNase污染，则必须反复酚-氯仿抽提去除残留的RNase，然后再乙醇沉淀质粒DNA。
二、体外转录反应
5.如果有N个样品，强烈建议做一个阴性对照，故共设置N+1个反应，这样一起并排电泳时容易判断哪个条带是模板DNA，哪个条带是扩增得到的RNA。在N+1个RNase-free的塑料离心管中，在室温下（不是在4℃下）按次序加入下列成分（T7转录预配液容易产生结晶沉淀，一定要握在手中直到结晶彻底溶解并摇匀后方可使用）：
成分                                                                 N个样品管                                      阴性对照管
DNA模板                           50 ng左右的PCR片段或1 μg左右的线状质粒               不加
T7转录预配液，2×                                各10 μL                                                     10 μL
T7 RNA聚合酶-RI混合液                       各1 μL                                                       1 μL
补RNase-free水到                                 20μL                                                         20μL
注：此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。本产品的T7转录预配液已经含有NTP。如果需要标记RNA探针或制备带帽RNA，则需要订购NTP分开的试剂盒。
6.37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能大幅提高产量。
7.加入2μL自备的500mM的EDTA溶液灭活T7 RNA聚合酶。
8.取1-3 μL电泳，此时最好用DNA模板做电泳对照。电泳时比阴性对照多出的条带就是扩增得到的RNA（由于合成的RNA长度不均匀，即使长度均匀，但由于自生形成发夹结构，泳动速度也不一致，所以电泳所得RNA条带一般都不是清晰，而是比较弥散的电泳条带。但由于RNA是单链，分子量比同样长度的DNA小一倍，因此RNA一般比其双链DNA模板电泳速度更快。
9.定量，可以用自备的单链RNA定量试剂盒检测浓度。不推荐使用电泳定量。使用本试剂盒时1μg DNA模板一般可以合成2-6μg的RNA。
10.得到的RNA可以放-80℃保存。如需去除DNA模板，请按下面步骤操作。
三、去除DNA模板（所需试剂需要另购）
11.在20μL体积的体外转录体系中加入2μL的10×DNase Buffer和1 μL自备的 RNase-free DNase（3-5 U/μL）。
12.37℃保温30分钟。
13.补RNase-free水到100 μL。增加体积可以减少样品的丢失。
14.用自备的等体积（100 μL）的Tris饱和酚-氯仿，震荡混匀后14000g离心3分钟，将上清转移到新的离心管中。此步去除DNase和RNA聚合酶。
15.加自备的200 μL无水乙醇和10μL 3M的乙酸钠溶液（pH5.2），振荡后14000 rpm离心20分钟，RNA形成沉淀，弃上清。
16.在沉淀中加入1 mL 75%乙醇，震荡10秒后14000g离心5分钟，弃上清。
17.短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。不要丢失沉淀。
18.晾干，所得沉淀即体外转录所得的RNA。

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