CAT#:JW-220113-100
常温运输，2-8℃保存

免提取LAMP试剂盒（电泳法）

产品及特点
LAMP即Loop-Mediated Isothermal Amplification（环介导等温扩增），它利用4条模板专一的特异引物、和具有链置换能力的Bst DNA 聚合酶2.0（8U/uL），在等温条件下（65℃左右） 30-60分钟完成逆转录和LAMP扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于定性PCR技术，同时还不需要昂贵的仪器设备。目前已成功应用于生物的快速检测，广泛用于各个领域。免提取LAMP，即在传统LAMP技术的基础上，免去DNA步骤。它有下列特点:
1.操作简单，只用一步（约5-10分钟）即可以得到用于LAMP扩增的模板。
2.即开即用，含有红色电泳示踪剂，扩增后可以直接上样，不需要上样液。
3.高特异性，精心优化的配方，非特异扩增比自配的试剂更低。
4.可以直接从几乎所有的分子生物学样品（包括细菌、真菌、植物、动物、法医样品、石蜡组织切片等）中免提取LAMP扩增。
5.65℃左右等温扩增，不需要贵重仪器。
6.环保健康，不使用任何有毒有害的试剂。
7.本规格足够处理100个样本，足够50次20uL体系的LAMP扩增。

规格及成分
本产品采用塑料袋包装
成份                                    编号                规格    包装
广谱DNA释放剂                   220321        5 mL     5.0mL绿盖管
4×LAMP MasterMix
（含电泳示踪剂，待加酶）    220113a    200uL    0.5mL白盖管
Bst DNA聚合2.0，8U/uL      11-220319    50uL    0.5mL红盖管
阳性对照模板-引物混合物     210801        50uL    0.5mL蓝盖管
使用手册                               220113sc    1份         无

运输及保存
常温运输，2-8保存，有效期一年。

自备试剂
TE缓冲液

使用方法
一、LAMP扩增模板制备
注意：如果有N个样品，最好设置N+2个样品制备，多出的两个：一个是样品制备阳性对照，一个是样品制备阴性对照。
1.在1.5mL或0.5mL的塑料管中加入50μL广谱DNA释放剂。
2.再加入2μL液体样品（如全血、细胞培养液等）或2 mg（约半粒芝麻大小）的固体样品（如动物组织、植物叶片等）。注意：固体样品用量最好不要超过1 mg/10μL的比例，液体样品用量最好不要超过1μL /10μL的比例。
3.对于液体样品，室温放置3分钟；对于固定样品80℃加热5分钟；对难以破裂的样品（如有厚壁的真菌、石蜡切片、血斑），则保温时间可以延长到10分钟。得到的溶液称为样本裂解产物。
4.简短振荡混匀后取样品裂解产物立即取0.5uL直接进行20μL体系的LAMP扩增或其他扩增。注意：加入裂解产物体积不要超过LAMP反应体积的1/40。
二、LAMP扩增
5.配制5×LAMP引物混合液
    先加超纯水将合成的HPLC级别的下列引物干粉稀释到下表所标注的母液浓度，然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物母液和超纯水，最后得到1mL的5×LAMP引物混合液，此混合液足够250次20uL体系的LAMP扩增。如果需要配制的5×LAMP引物混合液体积异于1mL，则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置2年。
引物名称    母液浓度    加母液量    在5×LAMP引物混合液中的浓度
FIP引物    100 uM    80 uL    8 uM
BIP引物    100 uM    80 uL    8 uM
F3引物    100 uM    10 uL    1 uM
B3引物    100 uM    10 uL    1 uM
Loop F    100 uM    20 uL    2 uM
Loop B    100 uM    20 uL    2 uM
超纯水        780 uL    
终体积        1mL    
注：如果没有Loop引物，则用超纯水补足其体积。
6.在冰上融化4×LAMP MasterMix（待加酶），混匀，稍离心。第一次使用时，请将50uL Bst DNA聚合酶2.0(8U/uL)全部加入到4×LAMP MasterMix中并轻柔混匀至少1分钟，然后再使用。如果有N个样品，则在N+2个反应管中加入以下组份，多出的一管是LAMP扩增阳性对照（PC），一管是LAMP扩增阴性对照（NC）：
成份                    N+2个样品管    LAMP扩增PC    LAMP扩增NC
4×LAMP MasterMix
（加酶后）                5 uL            5uL                    5 uL
自备的5×LAMP引物
混合液                   4 uL                     不加                   4 uL
阳性对照模板-引物混合物     不加    4 uL                    不加
释放的DNA模板    0.5 uL                    不加                    不加
补自备超纯水到    20 uL                    20 uL                    20 uL
7.混匀，置于65℃保温60分钟。如果是在PCR仪中保温，必须加热盖。如果用金属浴或水浴保温，没有热盖，必须覆盖50uL的自备石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，会严重影响反应效率。
8.扩增结束后取5-10uL扩增产物直接上样（本产品含有红色电泳示踪剂，不需要再加上样液，红色示踪剂的泳动速度相当于50bp的DNA）进行2-3%的琼脂糖凝胶电泳，有LAMP扩增的样品将可见LAMP特征性DNA梯度电泳图谱（见下图）：
9.结果分析：如果本试剂盒提供的阳性对照-引物混合物能够扩增而阴性对照不能扩出，则实验有效。如果阳性对照-引物混合物没有扩增出条带，则试剂盒的问题，请跟厂家联系。如果阴性对照（水作为模板）有扩增出条带，则说明LAMP样品或试剂有过去的扩增产物的污染，需要注意操作的规范性，如果不能解决，可以重新设计LAMP引物扩增新的靶片段。

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