CAT#:JW-211246
常温运输和保存

非变性PAGE电泳试剂盒（DNA用）

产品及特点
在非变性PAGE中，DNA的迁移率除跟长短相关外，还跟其构象和结合的蛋白质相关，因此DNA的非变性PAGE电泳是研究SSCP-PCR（Single-strand Conformation Polymorphism-PCR、单链PCR片段构象多态性）和凝胶滞阻（Gel Shift）的重要研究手段。本产品就是专门用于DNA非变性PAGE的试剂盒，它具有下列特点:
1.一站式，用户只需要准备去离子水和样品，不需要单独优化各种条件，十分方便。
2.安全，免去了实验人员接触粉末状的有毒物品丙烯酰胺。
3.PAGE电泳后可直接用于银染等后续试验。
4.可以用于SSCP和Gel-Shift实验。
5.本产品足够30次mini PAGE凝胶电泳。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品第一部分，大纸盒包装，常温运输和保存。
成份                                        编号       规格       包装
丙烯酰胺，电泳级                211237a    60 g       250 mL棕色瓶
甲叉双丙烯酰胺，电泳级    100877       2 g        10 mL棕色瓶
TBE电泳液，10×                  90313     250 mL    250 mL本色瓶
TEMED                            110-18-9      1.5 mL    2.0 mL白色盖
过硫酸铵                            100879       1 g         2.0 mL绿色盖
使用手册                        100205sc       1份        1份
本产品第二部分，塑料袋包装，低温运输，-20℃保存。
成份                                            编号        规格       包装
2×DNA非变性PAGE上样液    100875    1.5 mL    2.0 mL棕盖管

运输及保存
大纸盒常温运输，塑料袋低温运输，收到货后两部分的保存条件见上表，有效期一年。

自备试剂
去离子水、核酸银染试剂盒

使用方法
下面的操作步骤是以SSCP-PCR的非变性PAGE电泳为例，其他应用请相应修改相关参数。
1.PAGE浓度的选择：根据SSCP-PCR和Gel-Shift的DNA长度选择PAGE凝胶的浓度。5%的PAGE的有效分辨范围为80-500 bp、8%的PAGE的有效分辨范围为60-400 bp、12%的PAGE的有效分辨范围为40-200 bp。
2.体积的选择：SSCP-PCR检测需要长约30-40 cm的测序胶板，Gel-Shift实验一般只使用长度为8-10 cm的mini 凝胶，可以结合梳子的厚度，计算所需PAGE胶的体积。
3.配制PAGE胶（下面以配制100 mL PAGE胶为例计算用量，配制更大体积的胶则需以此用量为基础按比例增加）：
A：新鲜配制10%的APS（过硫酸铵）：称量约0.1克硫酸铵干粉到一个1.5 mL EP管中，按每0.1克过硫酸铵干粉加1 mL自备去离子水的比例将水加到管中，摇晃到硫酸铵粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周，超过一周不能再用。
B：新鲜配制30%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液（29:1）：将2 g甲叉双丙烯酰胺倒入到装有60 g丙烯酰胺的250 mL棕色塑料瓶中，天平上去皮，加入146 mL自备的去离子水，充分摇晃直到溶解（约需10-20分钟）。此溶液简称为30% AB溶液，最好在一个月内用完，4℃保存。
C：配SSCP PAGE胶：在一个250 mL的三角瓶中，先按下表的用量加入去离子水、30% AB 溶液和10×TBE电泳液。丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
PAGE胶浓度       各成分用量（单位：mL）           总体积（mL）
            去离子水    30% AB溶液    10×TBE电泳液    
5%           73.4            16.6                   10.0                100
6%           70.0             20.0                   10.0                100
7%           66.7            23.3                    10.0                100
8%           63.3            26.7                   10.0                100
9%           60.0            30.0                   10.0                100
10%         56.7            33.3                   10.0                100
11%         53.3            36.7                   10.0                100
12%         50.0            40.0.                   10.0               100
注：有大量文献报道PAGE胶中加入5%-10%的甘油能提高SSCP分析时某些位点的分辨率。如果选择加入10%的自备甘油，则减少去离子水的用量10 mL，同时加入10 mL甘油原液。
C：摇晃混匀。最好能抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应），无条件也可以不脱氧。
D：加入500 μL 10%APS和100 μL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
E: 在PAGE胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
F: 室温聚合30-60分钟（低温抑制聚合反应，故最好室温）。
G: 待PAGE胶凝固后拔出梳子，用1×TEB液冲洗加样孔。
H: 放4℃冰箱预冷30分钟-12小时。为了防止PAGE胶收缩，最好在其顶部加少量1×TBE缓冲液。使用预冷的PAGE胶有利于单链DNA在电泳时保持其构型，这些构型靠DNA序列间的微弱的链内互补形成，对温度很敏感。温度越高，这些微弱相互作用越不稳定。
4.将预冷后的PAGE凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够1×TEB电泳液。
5.取3-5 μL SSCP-PCR样品，加入等体积2×DNA非变性PAGE上样液，85℃处理5分钟后冰浴。用前短暂离心后取2 μL上样。上样量跟检测方法的灵敏度相关，上述上样量是针对核酸银染检测法。
6.连接电源线，打开电源开关。如果PAGE中不含甘油，则使用25 W的功率，电泳5-7小时（对3-40 cm长的PAGE胶而言）。如果使用含甘油的PAGE，则使用8W的功率，电泳16-18小时。由于温度变化过大会改变DNA构型，所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的PAGE，最好恒温在4℃、对含甘油的PAGE，最好恒温在25℃。
1.终止电泳，取出凝胶进行后续的银染处理。不建议使用灵敏度低于银染的方法，因为SSCP异构体的数量都比较少，一般方法没法检测到。

疑难解答
一、为何SSCP-PCR带型有复合条带？
原因之一：可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。原因之二：可能是PCR产物用量过高，彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4-8倍后使用。
二、如何提高电泳分辨率？
可以在配胶时加入甘油（终浓度为5%-10%），因为甘油是弱变性剂，能部分展开DNA折叠结构，增加表面积，增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大，电泳速度变慢，因此只适合室温电泳使用，不要4℃电泳。如果条件允许，最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。

关联试剂
核酸银染试剂盒