CAT#:JW-211237-30
常温运输和保存，有两个成分低温运输和保存

miRNA尿素-PAGE试剂盒

产品及特点
尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea PAGE)是目前分离200 nt以下的小片段RNA，尤其是20 nt左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是单独配制各种溶液十分繁琐，为此本公司开发了本产品。它具有下列特点:
1.一站式，含有电泳所需要的所有试剂，即开即用，十分方便，免去了实验人员称取有毒物品。
2.灵活，可以根据需要配制各种浓度的Urea-PAGE，以便对长度各异的RNA进行电泳。
3.电泳后可直接用于UV观察、银染、胶回收、Northern杂交等实验。
4.使用新型上样缓冲液，可以防止甘油的干扰。
规格及成分
本产品第一部分为大纸盒包装，常温运输
成份                                   编号                规格            包装
尿素                                    100873        105 g×2        250 mL本色瓶
丙烯酰胺，电泳级                211237a       60 g           125 mL棕色瓶
甲叉双丙烯酰胺，电泳级    100877            3 g            10 mL棕色瓶
TBE电泳液,10×                    90313        250 mL         250 mL本色瓶
TEMED                                110-18-9       1.5 mL       1.5 mL白盖管
过硫酸铵                                100879        1 g            1.5 mL绿盖管
固相RNase清除剂                    3090       250 mL       250 mL本色瓶
使用手册                               211237sc    1份               1份
本产品第二部分为塑料袋包装。低温运输
成份                                                        编号        规格        包装
2×miRNA尿素-PAGE上样液                 970608    1.5 mL    1.5 mL红盖管
miRNA电泳分子量标准（15-50 nt）    220154    150 μL    1.5 mL蓝盖管

运输及保存
常温运输和保存，其中miRNAon、miRNA Marker需要低温运输，-20℃保存，保存期一年。

自备试剂
miRNA样品、RNase-free水。

使用方法
1.准备工作：用固相RNase清除剂清洁工作平台
直接将固相RNase清除剂原液或10倍的新鲜稀释液喷于台面，5分钟后用普通吸水纸擦净，最后用沾有固相RNase清除剂1000倍新鲜稀释液的吸水纸擦净，晾干。
2.准备工作：用固相RNase清除剂清洁玻璃和塑料器皿将器皿浸泡在固相RNase清除剂的10或100倍的新鲜稀释液中，静置处理5分钟后取出，再用固相RNase清除剂1000倍或10000倍新鲜稀释液浸泡二次以上，倒立晾干后备用。
3.配制1×TBE电泳液:将适量的10×TEB电泳液用RNase-free水稀释10倍，得到1×TBE电泳液待用。此溶液需要现用现配，否则易长菌。
4.配制10%过硫酸铵溶液:精确称取约100 mg过硫酸铵到一干净的1.5 mL离心管中，按每1 mg过硫酸铵加10 μL RNase-free水的比例加入RNase-free水，摇晃溶解待用。10%过硫酸铵溶液有效期不要超过一周。
5.估计所需要的凝胶溶液的体积，一般配制一块13 cm×15 cm×0.8 mm的胶需要15 mL凝胶溶液，配制一块36 cm×45 cm×0.8 mm的胶需要120 mL凝胶溶液。
6.配制40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液：将3 g甲叉双丙烯酰胺全部倒入装有60 g丙烯酰胺干粉的瓶中，加入130 mL自备的RNase-free水，充分摇晃混匀即得40%的Acrylamide/Bis（20:1）溶液。
7.根据所需要的凝胶溶液的体积，在一的干净的三角瓶中按下表加入各成分（此处以配制100 mL Acrylamide/Bis终浓度为15%的凝胶为例）:
成份                                    终浓度    用量
尿素                                   7 M    42 g
40%Acrylamide/Bis溶液    15%    37.5 mL
10×TEB电泳液                    1×    10 mL
补RNase-free水到100 mL
注:Acrylamide/Bis的终浓度需要根据待分离RNA长度选择(见下表)。
需分离的RNA长度范围    Acrylamide/Bis终浓度
6-100 nt                                20 %
25-150 nt                               15 %
40-200 nt                                12 %
8.搅拌并加热到40-50℃左右，直到尿素完全溶解。
9.冷却到室温后，将三角瓶接上真空系统抽真空处理10-15分钟以充分去除溶液中的氧气（氧气会降低聚合反应效率）。若条件有限，此步可省略。
10.边摇晃溶液变加入50 μL TEMED和500 μL10%过硫酸铵溶液。注意：如果选择其他工作浓度的Acrylamide/Bis，此二成分的用量不需要随之改变。但如果配置的凝胶溶液的体积变化，此二成分的用量要按比例改变。
11.再充分摇晃约30秒后迅速灌胶，然后插入样品梳，室温放置30-60分钟等待胶凝固。
12.将凝胶板放置在电泳装置上后，在上下层分别加入适当量的1×电泳缓冲液。如果不马上使用，需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。
13.拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液，充分将每个加样空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。
14.在上样前，预电泳20-30分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空，同时还可以使凝胶的温度升高（到50℃左右），有利于RNA变性状态。
15.将5 μL miRNA样品与和5 μL miRNA电泳分子量标准（15-50 nt）分别和5 μL的2×miRNA上样液混合，70℃保温2-3分钟后迅速放置在冰上冷却，快速离心半分钟，放冰上待用。可以增加miRNA样品的用量，但上液需要等比例增加。
16.关电泳仪后开始上样。10 μL混合液需要全部上样。
17.重开电泳仪，对13 cm×15 cm的胶，以20-30 mA的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止；对36 cm×45 cm的胶，则以50-60 mA的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止。
18.染色观察：将凝胶一面的玻璃板揭开，直接用仍然附着在另一玻璃板上的凝胶进行各种染色，包括银染（需单独购买试剂盒）、EB染色（每100 mL 1×TBE中加20 μL 10 mg/mL的EB溶液）、克必隆低毒核酸染料染色（每100 mL 1×TBE中加10 μL低毒核酸染料）。如果用后两种染色法染色，需要在UV下观察并拍照。本产品提供的miRNA Marker有5条带，从上到下的长度分别为：50 nt、40 nt、30 nt、20 nt和15 nt。
19.其它后续处理（本试剂盒不含所需试剂），流程仅仅供参考。
miRNA回收：在UV下确定所需要的miRNA条带的位置，切胶后进行胶回收处理（需要单独购买试剂盒）。
Northern杂交：UV观察后将凝胶中的RNA电转移到带正电的尼龙膜上，然后进行杂交处理。
放射自显影：如果miRNA样品电泳前经过同位素标记，则将凝胶一面的玻璃板揭开，用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来，然后包上保鲜膜，真空抽干，然后使胶跟X光片向对置进行放射自显影。

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