CAT#:JW-211226-50
第1部分：常温运输和保存，第2部分：低温运输，-20℃保存

免提取LAMP试剂盒（可视染料法）

产品及特点
本产品是4×LAMP MasterMix（可视染料法）和免提取样本DNA释放剂的组合。前者含有可视化LAMP扩增所需的所有成分，可以用于可视化LAMP等温扩增。免提取样本DNA释放剂可用于处理各种样品，直接不经过提取直接用于PCR或LAMP扩增。本试剂盒具有下列特点：
1.即开即用，用户不需要单独准备每个成分。
2.不需要单独进行核酸纯化，LAMP扩增后可以直接肉眼观察，不需任何设备。
3.高特异性，精心优化的可视化LAMP MasterMix配方，非特异扩增比自配的LAMP试剂更低。
4.4×MasterMix，比对应的2×MasterMix能使用能多的扩增模板。如果样品没有抑制物，最多可使用11uL进行扩增，降低漏检的机率。
5.高扩增效率，一般比PCR灵敏一个数量级。
6.本试剂盒足够50次免提取样本处理和50次20uL体系的LAMP扩增。
7.提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。
8.本产品只能用于科研，不能用于临床。
规格及成分
免提取LAMP试剂盒第1部分，编号211226pt1，规格50次，5孔盒包装，常温运输和保存。
成 份            编 号        规 格        包 装
免提取DNA模板制备溶液A成分1     210904a1        0.1 mL        0.5 mL白盖管
免提取DNA模板制备溶液A成分2    210904a2        0.1 mL        0.5 mL紫盖管
免提取DNA模板制备溶液B    210904b        0.5 mL        0.5 mL绿色盖
免提取LAMP试剂盒第2部分：编号211226pt2，规格50次，5孔盒包装，低温运输，-20℃保存。
成 份                                                                      编 号       规 格    包 装
4×LAMP MasterMix（可视染料法，待加酶）     211221a    200uL    0.5mL黄盖管
Bst DNA聚合酶                                                   211202b    50uL    0.5mL红盖管
阳性对照模板-引物混合物                                   211202c    50uL    0.5mL蓝盖管
使用手册                                                            211226sc    1份    

运输及保存
第1部分常温运输和保存，第2部分低温运输，-20℃保存。有效期一年。

自备试剂
超纯水、LAMP模板、LAMP引物

使用方法
1.打开金属浴或PCR仪，把温度调到95℃。
2.配制1mL工作液（足够10个样品，如果样品不止10个，需要按比例增加）：在一干净的1.5mL自备塑料离心管中加入10uL免提取模板制备溶液A成分1，20uL免提取模板制备溶液A成分2和970uL超纯水，充分混合均匀待用。溶液A工作液可室温放置，但最好在一周内用完。
3.标记10个PCR管（方便后续用PCR仪加热保温），分别加入100 uL上步所配制的溶液A工作液。
4.参考下表在管中加入待处理样品。如果是固体样品，需要确保固体样品被溶液A工作液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀即可。动物组织1-5 mg、鼠尾2mm、血液样品不超过20 uL、植物叶片1-5 mg、植物种子1-5 mg、0.2-0.5mL微生物培养物离心所得的沉淀、血清血浆等蛋白浓度高的液体样品10-30 uL、其他液体样品（如保存液中的病毒样品）50-100 uL。对上表未列出的样品，用户需要自己摸索最佳用量。对富含多醌多酚的植物材料（如棉花），使用量最好不要超过0.5mg。
5.在金属浴或PCR仪上95℃保温10分钟。
6.待冷却到常温。
7.每个管中加入10uL溶液B并轻柔吹打混匀得DNA释放液。这些DNA释放液足够进行50-100次PCR或LAMP扩增。
8.配制5×LAMP引物混合液。
先加超纯水将合成的HPLC级别的下列引物干粉稀释到标准所标注的母液浓度，然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物母液和超纯水，最后得到1mL的5×LAMP引物混合液，此混合液足够250次20uL体系的LAMP扩增。如果需要配制的5×LAMP引物混合液体积异于1mL，则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置2年。
引物名称    母液浓度    加母液量    在5×LAMP引物混合液中的浓度
FIP引物    100 uM    80 uL    8 uM
BIP引物    100 uM    80 uL    8 uM
F3引物    100 uM    10 uL    1 uM
B3引物    100 uM    10 uL    1 uM
Loop F    100 uM    20 uL    2 uM
Loop B    100 uM    20 uL    2 uM
超纯水        780 uL    
终体积        1mL    
注：如果没有Loop引物，则用水替代。
9.在冰上融化4×LAMP MasterMix（可视化法），混匀，稍离心。第一次使用时，请将50uL Bst DNA聚合酶全部加入到4×LAMP MasterMix中轻柔混匀，然后再使用。如果有N个样品，则在N+2个反应管中加入以下组份，多出的一管是LAMP扩增阳性对照（PC），一管是LAMP扩增阴性对照（NC）：
成份                                    N+2个样品管    LAMP扩增PC    LAMP扩增NC
4×LAMP MasterMix（加酶后）       5 uL          5 uL              5 uL
自备5×LAMP引物混合液                  4 uL         不加             4 uL
阳性对照模板-引物混合物                不加         4 uL             不加
自备模板DNA                                  1-2uL        不加             不加
补自备超纯水到                                20 uL        20 uL          20 uL
10.混匀，置于65℃保温60分钟。如果是在PCR仪中保温，必须加热盖。如果用金属浴或水浴保温，没有热盖，必须覆盖50uL的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，严重影响反应效率。
11.扩增结束后肉眼观察结果判断阴性和阳性。典型的结果见下图：左边管为阴性，右边两个管为阳性。
12.结果分析：如果本试剂盒提供的阳性对照-引物混合物呈现阳性而阴性对照为阴性，则实验有效。如果阳性对照-引物混合物呈现阴性，则操作有问题或者试剂盒有问题，请跟厂家联系。如果阴性对照（水作为模板）也呈现阳性，则说明LAMP样品或试剂有过去的扩增产物的污染，需要注意操作的规范性，如果不能解决，可以重新设计引物扩增新的靶片段。
13.也可以电泳检测实验结果（强烈不推荐此法，因为电泳时产生的气溶胶非常容易污染环境，使得今后用同一引物扩增时产生假阳性）：取5-10uL扩增产物和自备的上样液混合，上样，进行2-3%的琼脂糖凝胶电泳，有LAMP扩增的样品将可见LAMP特征性电泳图谱。

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