CAT#:JW-220102
常温运输及保存

质谱兼容PAGE胶蛋白银染试剂盒

产品及特点
银染是目前检测PAGE胶蛋白质条带的最灵敏的方法，MS（质谱）是确定未知蛋白最常用和最快捷的方法，但将银染得到的蛋白直接用于MS分析有很多问题，其中最主要问题是常规银染所使用的试剂（包括强氧化剂和醛类）容易使蛋白质发生共价化学修饰，MS分析得到的修饰后的氨基酸信息跟蛋白质实际的没有修饰的氨基酸信息并不相同。为了使银染得到的蛋白质可以用于MS分析，为此本公司开发MS兼容型银染试剂盒，其特点如下：
1.跟MS兼容。整个过程不使用能对蛋白质进行化学修饰的试剂，所得蛋白质没有发生化学修饰，故可直接用于后续的MS（包括MALDI-TOF-MS和ESI-MS）分析。
2.银染的染色灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍左右，可达0.2-0.6 ng蛋白质/条带。
3.可用于各种PAGE胶，包括变性PAGE胶（如SDS-PAGE，尿素-PAGE），非变性PAGE胶，IEF胶（等电电泳胶），2D胶等。
4.四种溶液都是现用现配，实验结果的可重复性好。
5.本试剂盒足够染色10块10×10 cm PAGE胶。
6.本试剂盒只能用于科研。
规格及成分
本试剂盒使用大扁盒包装
成 份          编 号     规 格    材料
银染溶液A组分一    220102a1    5 g    10 mL本色瓶
银染溶液A组分二    220102a2    100 mL    125 mL本色瓶
银染溶液A组分三    220102a3    22.5 g×10    60 mL本色瓶
银染溶液B组分    220102b    5 g    10 mL棕色瓶
银染溶液C组分一    220102c1    5 g×10    10 mL本色瓶
银染溶液C组分二    220102c2    2 mL    5 mL本色瓶
银染溶液D 组分    220102d    2.92 g×10    10 mL本色瓶
使用手册         220102sc    1份    1份

运输及保存
常温运输及保存，有效期一年。

自备试剂
MilliQ水（或电导在5M以上的去离子水），分析纯甲醇和分析纯乙酸。

使用方法
说明
所有溶液均需现配现用。以下操作是针对一块10×10 cm PAGE胶需要200 mL各种溶液的比例配制，用户可以根据自己PAGE胶的大小增减溶液的配制量。整个过程一定戴手套操作，避免皮肤脱落角质蛋白对实验的干扰。所用容器（如托盘）最好是干净的玻璃容器。
一：配制400 mL固定液
1.将160 mL甲醇、40 mL乙酸和200 mL MilliQ水充分混合后即得400 mL固定液，常温放置待一次性使用。按一次银染需要固定2次，每次需使用200 mL固定液。
二：配制200 mL银染溶液A
2.先配制银染溶液A组分一母液：将银染溶液A组分一干粉5 g（本试剂盒提供）加入到装有100 mL银染溶液A组分二的塑料瓶中，盖紧盖子后充分摇晃溶解即可。常温放置待用。此溶液剩余的可4℃长期保存。
3.将60 mL自备甲醇、8 mL上步所得银染溶液A组分一母液、1瓶银染溶液A组分三干粉（试剂盒提供）和132 mL 自备的MilliQ水充分混合后即得200 mL银染溶液A。常温放置待一次性使用。
三：配制200 mL银染溶液B
4.称0.5 g银染溶液B干粉，溶于200 mL自备的MilliQ水中，充分混合后即得200 mL银染溶液B。常温放置待一次性使用。
四：配制200 mL银染溶液C
5.将1份银染溶液C干粉溶解在200 mL自备的MilliQ水（干粉不容易溶解，需充分摇晃）即得银染溶液C（使用前还需要再加入160 μL溶液C组分二，但此时暂不加）。常温放置待一次性使用。
五：配制200 mL溶液D
6.将1份银染溶液D干粉溶解在200 mL自备的MilliQ水中即得银染溶液D。常温放置待一次性使用。
六：银染
7.PAGE电泳（包括非变性PAGE，SDS-PAGE，尿素-PAGE，2D-PAGE，IEF-PAGE等）结束后，将PAGE胶转移到装有200 mL固定液的瓷盘或玻璃盘中，摇晃30分钟以去除干扰银染的组分（如甘氨酸、SDS、尿素、DTT、甘油等），倒掉固定液。注：此步非常重要，否则银染背景会很高。
8.重复上步一次。
9.将PAGE胶转移到200 mL新鲜配制的银染溶液A中，室温摇晃30分钟。
10.用200 mL自备的MilliQ水漂洗3次，每次5分钟（不要延长或缩短）。
11.将PAGE胶转移到200 mL的银染溶液B中，室温摇晃20分钟。
12.用200 mL自备的MilliQ水漂洗2次，每次1分钟（不要延长或缩短）。
13.将PAGE胶转移到200 mL的银染溶液C中（使用前还需要往装有银染溶液C的瓶中再加入160 μL溶液C组分二并充分混匀），室温摇晃直到蛋白电泳条带显现，此步一般需要10分钟左右，具体时间取决于蛋白的浓度。
14.将PAGE胶转移到200 mL的银染溶液D中，室温摇晃终止反应。
15.用200 mL自备的MilliQ水漂洗3次，每次5分钟（不要延长或缩短）。
16.切下蛋白电泳条带或胶块进行后续的脱银，原位trypsin酶解，多肽沉淀和MS分析（略）。
附
MS前处理步骤（仅供参考，本试剂盒不含相关试剂）
17.脱银：将切下的银染斑点或条带用脱银液（30 mM K3Fe（CN）3和100 mM Na2S2O3的1：1的混合液）处理直到黑色消失。
18.还原：将胶块或胶条置于10 mM DTT（溶剂为50 mM NH4HCO3），56℃处理一小时。
19.烷化：将胶块或胶条置于55 mM 碘乙酰胺（溶剂为50 mM NH4HCO3），室温避光处理45分钟。
20.原位trypsin酶解：将胶块或胶条置于10 ng/μL测序级别的trypsin溶液中（溶剂为25 mM NH4HCO3），37℃处理过夜。
21.多肽提取：用5%三氟乙酸抽提酶解液，再用2.5%三氟乙酸-50%ACN混合液抽提酶解液，上清真空干燥，沉淀物（多肽）最后溶于0.5%三氟乙酸中。
22.MS分析：参考相关MS仪器使用手册。

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