CAT#:JW-211262-50
低温运输，-20℃保存

4×UNG-LAMP MasterMix（可视化染料法）
使用手册V1.0

产品及特点
4×UNG-LAMP MasterMix（可视化染料法）含有可视化UNG-LAMP扩增所需的所有成分，可以用于可视化UNG-LAMP等温扩增。LAMP即Loop-Mediated Isothermal Amplification（环介导等温扩增），它利用4条模板专一的特异引物和具有链置换能力的Bst DNA聚合酶，在等温条件下(63℃左右) 30－60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于定性PCR技术，同时还不需要昂贵的仪器设备。目前已成功应用于生物的快速检测，广泛用于各个领域。本试剂盒具有下列特点：
1.即开即用，含有可视化染料和UNG，扩增后可以直接肉眼观察，不需要仪器设备。同时有UNG-dUTP防污染系统。
2.高特异性，精心优化的配方，非特异扩增比自配的试剂更低。
3.4×MasterMix，比对应的2×MasterMix可使用更多的扩增模板。最多可达11 mL，降低漏检的机率。
4.高扩增效率，一般比PCR灵敏一个数量级。
5.65℃左右等温扩增，不需要贵重仪器。
6.本试剂盒足够50次20 mL体系的UNG-LAMP扩增。
7.提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。
8.本产品只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分
成份                                                编号    规格    包装
4×UNG-LAMP MasterMix
（含可视化染料，待加酶）    211262a    200 mL    0.5 mL黄盖管
Bst DNA聚合酶-UNG             211262b     50 mL    0.5 mL红盖管
阳性对照模板-引物混合物       210801     50 mL    0.5 mL蓝盖管
使用手册                                211262sc    1份        无
本产品采用五孔盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
LAMP模板、LAMP引物

使用方法
1.制备模板DNA：用于选用合适的方法制备模板DNA。如果有N个样品，最好设置N+2个样品制备，多出的两个一个是样品制备阳性对照，一个是样品制备阴性对照。
2.配制5×LAMP引物混合液。
先加超纯水将自备的HPLC级别的下列引物干粉稀释到下表所标注的母液浓度，然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物母液和超纯水，最后得到1 mL的5×LAMP引物混合液，此混合液足够250次20 mL体系的LAMP扩增。如果需要配制的5×LAMP引物混合液体积异于1 mL，则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置2年。
引物名称    母液浓度    加母液量    在5×LAMP引物混合液中的浓度
FIP引物    100 mM       80 mL           8 mM
BIP引物    100 mM       80 mL           8 mM
F3引物     100 mM      10 mL            1 mM
B3引物    100 mM       10 mL            1 mM
Loop F     100 mM       20 mL            2 mM
Loop B     100 mM       20 mL           2 mM
超纯水     -                   780 mL              -
终体积     -                    1 mL                 -
注：如果没有Loop引物，则用水替代。
3.在冰上融化4×UNG-LAMP MasterMix（含可视化染料），混匀，稍离心。第一次使用时，请将50 mL Bst DNA聚合酶-UNG全部加入到4×UNG-LAMP MasterMix中轻柔混匀，然后再使用。对N+2个样品，则在N+4个反应管中加入以下组份，多出的一管是LAMP扩增阳性对照（PC），一管是LAMP扩增阴性对照（NC）：
成份                                    N+2个样品管    LAMP扩增PC    LAMP扩增NC
4×UNG-LAMP MasterMix
（含可视化染料，加酶后）      5 mL              5 mL               5 mL
自备5×LAMP引物混合液          4 mL              不加               4 mL
阳性对照模板-引物混合物      不加                 4 mL              不加
自备模板DNA                       1-11 mL            不加                不加
补自备超纯水到                     20 mL              20 mL              20 mL
4.混匀，置于65℃保温60分钟。如果是在PCR仪中保温，必须加热盖。如果用金属浴或水浴保温，没有热盖，必须覆盖50uL的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，严重影响反应效率。
5.扩增结束后肉眼观察结果判断阴性和阳性。典型的结果见下图：左边管为阴性，右边两个管为阳性。
6.结果分析：如果本试剂盒提供的阳性对照-引物混合物呈现阳性而阴性对照为阴性，则实验有效。如果阳性对照-引物混合物呈现阴性，则操作有问题或者试剂盒有问题，请跟厂家联系。如果阴性对照（水作为模板）也呈现阳性，则说明LAMP样品或试剂有过去的扩增产物的污染，需要注意操作的规范性，如果不能解决，可以重新设计引物扩增新的靶片段。
7.也可以电泳检测实验结果（强烈不推荐此法，因为电泳时产生的气溶胶非常容易污染环境，使得今后用同一引物扩增时产生假阳性）：取5-10 mL扩增产物和自备的上样液混合，上样，进行2-3%的琼脂糖凝胶电泳，有LAMP扩增的样品将可见LAMP特征性电泳图谱。

注意事项
1.引物设计对成功扩增十分关键，尽量以保守区设计引物。
2.引物至少包括F3/B3和FIP/BIP，加入环状引物F loop/B loop可以使反应速度大大提高。
3.应优化引物序列、GC含量和尽量避免二级结构。
4.LAMP扩增具有特异性好、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。但太高的灵敏度使得其比普通PCR扩增更加容易污染导致假阳性。因此，必须高度重视扩增产物的污染。常规措施包括严格的实验分区、使用荧光定量等不开盖检测方法。实验室一旦遭到污染，很难去除，最好重新设计引物扩增新的靶片段。

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