CAT#:JW-211263-50
低温运输，-20℃保存

4×UNG-LAMP MasterMix（荧光染料法）

产品及特点
4×UNG-LAMP MasterMix（荧光染料法）含有荧光染料法LAMP扩增所需的所有成分，可以用于荧光染料实时LAMP等温扩增。LAMP即Loop-Mediated Isothermal Amplification（环介导等温扩增），它利用4条模板专一的特异引物和具有链置换能力的Bst DNA聚合酶，在等温条件下(65℃左右) 30－60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于定性PCR技术，同时还不需要昂贵的仪器设备。目前已成功应用于生物的快速检测，广泛用于各个领域。本试剂盒具有下列特点：
1.即开即用，含有本公司开发的LAMP专用荧光荧光染料，比常规的SYBR更好，不会产生抑制。
2.含UNG防污染系统。
3.在荧光定量PCR一起上进行扩增时，可以实时跟踪扩增过程，但不宜用于定量（这是LAMP技术决定的）。
4.高特异性，精心优化的配方，非特异扩增比自配的试剂更低。
5.高灵敏度，一般比PCR灵敏一个数量级（取决于引物的筛选）。
6.4×MasterMix，最多可加入14 mL模板，降低漏检率。
7.本试剂盒足够50次20 mL体系的LAMP扩增。
8.提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。
9.本产品只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分
本产品使用五孔盒包装
成份            编号        规格    包装
4×UNG-LAMP MasterMix
（荧光染料法，待加酶）    211263        200 mL    0.5 mL绿盖管
Bst DNA聚合酶2.0        11-220319        50 mL    0.5 mL红盖管
LAMP阳性对照模板-引物混合物    220402        50 mL    0.5 mL黄盖管
使用手册            211263sc        1份    无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
DNA模板、LAMP引物

使用方法
1.制备模板DNA：用于选用合适的方法制备模板DNA。如果有N个样品，最好设置N+2个样品制备，多出的两个一个是样品制备阳性对照，一个是样品制备阴性对照。
2.配制自备的20×LAMP引物混合液。
先加超纯水将合成的HPLC级别的下列引物干粉稀释到下表所标注的母液浓度，然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物母液和超纯水，最后得到0.1 mL的20×LAMP引物混合液，此混合液足够100次20 mL体系的LAMP扩增。如果需要配制的20×LAMP引物混合液体积异于0.1 mL，则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置2年。
引物名称    母液浓度    加母液量    在20×LAMP引物混合液中的浓度
FIP引物    100 mM    32 mL    32 mM
BIP引物    100 mM    32 mL    32 mM
F3引物    100 mM    4 mL    4 mM
B3引物    100 mM    4 mL    4 mM
Loop F    100 mM    8 mL    8 mM
Loop B    100 mM    8 mL    8 mM
超纯水    -    12 mL    -
终体积    -    0.1 mL    -
注：如果没有Loop引物，则用水替代。
3.在冰上融化4×UNG-LAMP MasterMix（荧光染料法，待加酶），混匀，稍离心。第一次使用时，请将50 mL Bst DNA聚合酶2.0全部加入到4×UNG-LAMP MasterMix中轻柔混匀，然后再使用。如果有N个样品，则在N+2个反应管中加入以下组份，多出的一管是LAMP扩增阳性对照（PC），一管是LAMP扩增阴性对照（NC）：
成份            N+2个样品管    LAMP扩增PC    LAMP扩增NC
4×UNG-LAMP MasterMix（荧光染料法，加酶后）    5 mL    5 mL    5 mL
自备20×LAMP引物混合液                                           1 mL    不加    1 mL
LAMP阳性对照
模板-引物混合物                                                          不加    5 mL    不加
自备模板DNA                                                          1-14 mL    不加    不加
补自备超纯水到                                                          20 mL    20 mL    20 mL
4.混匀，置于荧光定量PCR仪器中65℃保温60分钟，每分钟采集一次SYBR通道的荧光信号。如果荧光定量PCR仪不能设置恒温扩增参数，可以把变性复性和扩增三个温度都设置为65℃，三个步骤的总时间为1分钟即可，共60个循环，在任何一步采集荧光信号即可。
5.结果分析：实验有效性判定。如果两个阳性对照能够得到标准的S型扩增曲线而两个阴性对照都没有扩增，则实验有效，才有必要对样品进行分析。如果阳性对照没有出现S型扩增曲线，则说明试剂盒可能失效，实验无效。如果阴性对照有S型扩增曲线，则说明LAMP引物设计得不好，有非特异扩增，需要重新优化引物。也可能是环境或试剂有污染，实验无效。遇到实验无效的情况，请跟厂家客户联系，分析原因后再恢复实验。
6.如果实验有效，则分析样品。凡是有S扩增曲线的，可以判断为阳性。凡是没有S扩增曲线的，可以判断为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性结果，扩增曲线为S型，右边为阴性结果，扩增曲线不呈S型。
    
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