CAT#:JW-210701
低温运输，-20℃保存

DNA探针生物素标记试剂盒（PCR法）

原理及特点
用PCR对DNA进行生物素标记的原理是用带生物素标记的dNTP进行PCR扩增，这些dNTP掺入到PCR产物中之后，扩增得到的DNA片段自然就带有生物素标记，可以直接用于杂交试验。本产品就是基于上述原理开发的，它具有下列特点：
1.一站式，本试剂盒经过精心优化，不需要用户自己摸索标记条件。
2.优化的生物素掺入率，能有效降低探针中生物素分子之间的可能空间阻碍，检测效果佳。
3.得到的生物素标记DNA探针可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落杂交和斑点印迹杂交等分析。
4.既可用于制备双链DNA探针，也可以用于制备单链DNA探针。
5.一次标记反应可以得到μg级的生物素标记双链DNA探针或约700 ng生物素标记单链DNA探针，足够多次杂交实验用。
6.本产品足够5次生物素标记PCR反应（50 μL体系）。
7.本产品只能用于科研。
规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成份                                       编号            规格        包装
标记专用PCR Mix(含酶)        210701a    30 μL    0.5 mL红盖管
dNTP Mix，2.5 mM each     210701b     25 μL    0.5 mL白盖管
含Biotin-11-dUTP的
dNTP，2.5 mM each         210701c        25 μL    0.5 mL绿盖管
超纯水                                210806-1      1 mL    1.5 mL蓝盖管
使用手册                            210701sc        1份       1份

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
DNA模板和模板专一性引物，常规PCR反应所需试剂，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

使用方法
一：准备工作
1.按常规的方法设计PCR引物，使PCR产物（探针）长度在400-800 bp之间。过短则生物素标记掺入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
2.为保证成功率，最好先用常规PCR产物制备DNA片段，再以之为模板进行标记PCR反应。不推荐以基因组DNA或其他背景复杂的DNA为模板直接进行PCR标记反应。
二：用常规PCR制备模板
3.用自备的PCR试剂盒按下表配置50 μL的常规PCR反应以制备标记PCR模板：
成份                                                           加入量
自备的2×PCR Mix（含酶，含dNTP）    25 μL
引物一和引物二（10 pmol/μL）             各5 μL
1 μg基因组DNA或1 ng质粒DNA            1 μL
超纯水                                                    补到50 μL
4.按引物Tm值设计的PCR参数进行常规PCR。
5.用自备胶回收试剂盒回收常规PCR产物并定量。胶回收步骤可以去残留引物，避免这些引物干扰后续的标记PCR反应。
三：标记PCR反应
注意：由于双链PCR探针在杂交时变性的双链彼此还会复性，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记PCR。在设置标记PCR时必须做一个常规PCR对照（本试剂盒足够5次标记PCR实验）。
成份                                                           标记PCR    常规PCR（自备）
标记专用PCR Mix（含酶）                            6 μL        6 μL
含Biotin-11-dUTP的dNTP，2.5 mM each      5 μL        不加
dNTP Mix，2.5 mM each                              不加         5 μL
若双链标记，加引物一和
引物二；
若单链标记，只加一条引物                各50 pmol        各50 pmol
胶回收所得PCR产物               10 ng（对双链标记）10 ng（对双链标记）
                                                100 ng（对单链标记）100 ng（对单链标记）   

超纯水                                               补到50 μL        补到50 μL
6.由于此步所用的PCR引物和第3步的PCR引物完全一样，故可以参考第3步PCR参数进行标记PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到35-55个循环，使扩增得到的探针DNA片段参差不齐，杂交时这种DNA能形成网络结构，杂交效果比长度整齐的DNA更好；二是延伸步骤的时间增加15秒，因为标记dUTP掺入到DNA的速度比常规的dTTP慢，增加延伸步骤的时间可以保证更多的标记dUTP掺入到合成的DNA探针中；三是降低复性温度5-7℃，因为标记核苷酸掺入到DNA后，含标记核苷酸的DNA的Tm值将比正常的DNA低。
7.PCR结束后，取标记PCR反应液和对照反应液3-5 μL进行琼脂糖凝胶电泳（一定要使用浓度已知的DNA marker），检测标记是否成功。由于标记DNA含有额外的标记物、分子量更大，其泳动速度将慢于常规PCR产物。下图是一个典型的双链标记PCR产物和常规PCR产物电泳速度差异的比较图：

标记的DNA（右）与未标记的DNA（左）电泳比较
8.探针的定量：电泳所用的DNA marker浓度已知（如果不确定，可以问供应商），上样体积已知，故上样量已知，就可通过双链探针DNA和DNA marker对应条带的相对亮度来估计探针DNA浓度。例如，如果探针长度为500 bp，而marker中500 bp这条带的浓度是10 ng/μL，共上样10 μL，则500 bp这条带的上样量为100 ng。标记的探针DNA在紫外下亮度只有它的一半，则探针DNA的上样量为100/2=50 ng，如果上样量是5 μL，则探针的浓度是50/5=10 ng/μL。但是，如果制备的是单链DNA探针，则不能按此法估计浓度，因为单链DNA结合核酸染料（如EB和SYBR GreenI）的能力远低于双链DNA。但可采用银染法定量（跟marker比较）。一般100 ng模板经单链标记PCR扩增可得到700 ng左右的单链探针。
9.单链PCR标记产物可以不经过纯化直接加入到杂交液中，双链PCR标记产物需要加热到95-100℃ 5分钟变性然后放冰上急冷后再加入到杂交液中使用。
10.如果探针不立即使用，需要放-20℃长期保存，不能放常温保存，否则Taq DNA酶的残留的外切酶活性会降解探针DNA。如果需要纯化探针DNA，请使用本公司的核酸探针纯化试剂盒（排阻层析法）（编号220887）。

疑难解答
问题：这个合成的标记DNA探针能不能用来做DNA pull down？
回答：可以。但由于标记核苷酸的掺入是随机的，大部分探针的结合位点处的核苷酸是不带标记分子的，但有少数探针该区域是带标记分子的，它们肯定会干扰该DNA区域与蛋白的结合，故实验时可能需要加入更多的探针DNA。具体用量需要自行优化。

关联产品
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（221176），核酸探针纯化试剂盒（220887）