CAT#:JW-210805
低温运输，-20℃保存

致突变PCR试剂盒

产品及特点
致突变PCR（error-prone PCR）是利用天然Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性，在一定条件下（如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在）能够按较高的机率引入随机引入突变而设计。如果有适当的突变选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体，用于人工诱变。本产品就是根据此原理开发得产品，它具有下列特点：
1.即开即用，十分简单方便，尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2.配方经过精心优化，突变率稳定，突变没有趋向性。致突变PCR的突变率为0.66%（±0.13%），详见使用手册疑难解答。
3.比体内基因突变更快捷简单，但如果在PCR引物中设计位点，则可使产物克隆到表达载体，也可以用于体内蛋白活性的筛选。
4.可用于连续致突变PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次致突变PCR的产物用作下一次致突变PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
5.只适用于扩增1kb以下的产物，对于1kb以上的产物，建议分段扩增。
6.本产品足够100次30uL体系的易错PCR反应。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分           
成份                                               编号       规格                包装
10×致突变PCR Mix（含酶）    210805a    300 uL    0.5mL红色盖
致突变PCR专用dNTP               210805b    300 uL    0.5mL黄色盖
致突变PCR增强剂                     210805c    300 uL    0.5mL白色盖
追加dNTP，0.5mM                    210805d    300 uL    0.5mL本色管
致突变PCR专用MnCl2                210805e    300 uL    0.5mL绿色盖
使用手册                                   210805sc    1份                无
本产品使用五孔盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存, 有效期为一年。

自备试剂
引物、DNA模板、超纯水。

使用方法
1.将自备的PCR引物稀释到10uM。引物是决定致突变PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25-30nt之间，GC含量在45%-60%之间，3端GC含量低，并且没有发夹结构。
2.用自备引物和自备的常规PCR试剂扩增制备致突变DNA模板（常规PCR产物），胶回收并准确确定浓度。注意：致突变PCR的模板一定要用胶回收的常规PCR产物，因为胶回收可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用致突变PCR引物扩增所得，在致突变PCR扩增时也会被扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。如果致突变PCR制备模板的引物和致突变PCR引物不同（类似巢式PCR）则可以避免此问题，但需要合成两对引物。本试剂盒只适用于扩增1kb以下的产物，对于1kb以上的产物，建议分段扩增。
3.将回收的DNA片段（模板）用水稀释到1ng/uL 、10ng/uL和100ng/uL三个浓度。注意：模板使用量是影响突变率的最重要因素，因为模板DNA为非突变DNA，扩增产生的DNA为突变DNA，致突变PCR体系跟常规PCR一样，最后会达到扩增平台，最终得到的扩增DNA的量是固定的，因此起始模板DNA使用量越大，则突变DNA在最终得到的总DNA中的相对比例就越低。但模板太少又不容易扩增成功，所以建议同时测试三个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的PCR产物进行分析。
4.设置30uL体系的致突变PCR反应。在一干净的PCR管中，加入下列成分。由于Mn离子容易跟其他成分发生沉淀反应，因此上机前最后加MnCl2：
成分                                               管1                                管2                    管3
10×致突变PCR Mix（含酶）         3 uL                            3 uL                    3 uL
自备DNA模板                               1 uL（1ng/uL）       1 uL（10ng/uL）    1 uL（100ng/uL）
自备致突变PCR引物
(10 uM each)                                各1 uL                       各1 uL                    各1 uL
致突变PCR增强剂                         3 uL                           3 uL                      3 uL
致突变PCR专用dNTP                    3                               3 uL                       3 uL
致突变PCR专用MnCl2                   3 uL                           3 uL                       3 uL
补自备超纯水                                加到30 uL                  加到30 uL                    加到30 uL
5.立即按下列参数进行易错PCR：
步骤        参数        循环数
PCR前变性        94℃ 3分钟    循环1次
致突变PCR        94℃ 1分钟    循环30-60次
        60℃ 1分钟    
        72℃ 3-10分钟    
注：由于致突变PCR含高浓度的镁离子，因此引物容易互为模板形成引物二聚体，因此使用60℃为复性温度。在错误碱基掺入后，DNA合成会暂时停滞，因此为了让DNA合成继续，需要延长合成的时间到3-10分钟。致突变PCR循环次数越多，突变DNA（扩增产物）与非突变DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的绝对数就越高，在同一模板上发生的突变位点数就越多，所以如果需要，可以做30、35、40、45、50、55、60次7个循环数的比较。
6.致突变PCR结束后，各取3uL进行电泳检查。
7.如果有预期大小的PCR产物，则全部电泳，进行胶回收，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的DNA为模板，再进行下一轮致突变PCR。
8.如果没有PCR产物，则按下列操作进行追加PCR。
9.在致突变PCR管中，加入3uL追加dNTP到27uL剩下的致突变PCR体系中，按下表进行追加PCR（chasing PCR）。
步骤                参数           循环数
追加PCR    94℃ 1分钟      循环20次
                 60℃ 1分钟    
                 72℃ 1分钟    
10.追加PCR结束后，再电泳检测。如果有条带，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的DNA为模板，再进行下一轮致突变PCR。
11.如果没有预期大小的PCR产物，则需要分析原因。
疑难解答
Q：致突变PCR的错误率是多少？
A：致突变PCR的突变率为0.66%（±0.13%），对500 bp的PCR产物，相当于有4%的PCR片段为野生型，12%的含一个突变，20%的含两个突变，22%的含三个突变，18%的含四个突变，12%的含五个突变，12%的含六个或更多突变。
Q: 如果需要每个核苷酸有高于0.66%的突变率，如何办？
A: 可以使用连续多次致突变PCR来提高突变率。但最好先用胶纯化回收PCR片段,再用于下一轮PCR。

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