动物细胞β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书
 
主要用途
动物细胞β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用化学方法，快速有效地裂解动物细胞，通过高速离心，获得澄清细胞裂解悬液，在β-半乳糖苷酶反应体系里，以邻硝基苯基-β-D- 半乳糖苷为无色底物，水解所产生的亮黄色的邻硝基酚，即采用比色法定量测定细胞裂解悬液制备样品中的β-半乳糖苷酶活性，藉此建立一种简单的定量评价报告基因的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于转基因后的活体细胞外源性以及衰老细胞内源性半乳糖苷酶活性分析。产品即到即用，性能稳定，参数优化，操作简便、比色敏感，堪称国际上同类产品最佳。
 
技术背景
大肠杆菌的标志基因Lac Z编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ； β-gal），在其催化作用下，半乳糖可从乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常稳定，对蛋白水解降解作用抗性强，且容易测试。因此β-半乳糖苷酶成为目前最常用的报告基因，以评价载体转染的效果。在衰老细胞内，显示β-半乳糖苷酶活性。邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyraniside；ONPG），是一种无色底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶的催化下，水解成无色的半乳糖和亮黄色的邻硝基酚（o-nitrophenol；ONP），通过420nm波长的吸光值分析，来测定β-半乳糖苷酶的活性单位。
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产品内容
清理液（Reagent A）      毫升
裂解液（Reagent B）        毫升    
稀释液（Reagent C）        毫升
反应液（Reagent D）    毫升
终止液（Reagent E）        毫升
产品说明书         1份

保存方式
保存裂解液（Reagent B）和反应液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）避免光照；有效保证6月

用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或96孔板：用于比色检测的容器
恒温水槽或培养箱：用于反应物孵育
计时器：用于反应计时
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤
实验开始前，开启分光光度仪预热，设置波长420nm；开启恒温水槽，设置温度为37℃。同时从－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent B）和反应液（Reagent D）置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）避免光照。然后进行下列操作：
一、样品准备
1）细胞样品
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
2）细胞培养液样品
1．移取5毫升待测细胞培养基到15毫升锥形离心管
2．放进台式离心机离心10分钟，速度为1500g
3．移取上清液到新的15毫升锥形离心管
4．（选择步骤）移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
5．置于冰槽里备用或放进-20冰箱里保存

二、活性检测
方法一：常规检测（比色皿）
1．移取100微升上述制备的细胞裂解悬液或培养液样品到新的比色皿
2．加入xx微升稀释液（Reagent C）
3．上下倾倒数次，混匀
4．放进37℃恒温水槽孵育5分钟
5．加入xx微升反应液（Reagent D）（注意：使用前，充分混匀反应液（Reagent D）中可能的沉淀）
6．上下倾倒数次，混匀，同时开启计时器进行计时
7．放进37℃恒温水槽孵育至少10分钟，或直至出现亮黄色（注意：参见注意事项15）
8．加入xx微升终止液（Reagent E），同时关闭计时器结束计时
9．记录反应所用的实际时间
10．即刻放入分光光度仪检测，记录样品吸光读数，理想读数为0.1至1.2范围内

方法二：微量检测（96孔板）
1．移取10微升上述制备的细胞裂解悬液或培养液样品到96孔板中的1个孔里
2．加入xx微升稀释液（Reagent C）
3．轻轻摇动96孔板数次，混匀
4．放进37℃培养箱孵育5分钟
5．加入xx微升反应液（Reagent D）（注意：使用前，充分混匀反应液（Reagent D）中可能的沉淀）
6．轻轻摇动96孔板数次，混匀，同时开启计时器进行计时
7．放进37℃培养箱孵育至少10分钟，或直至出现亮黄色（注意：参见注意事项15）
8．加入xx微升终止液（Reagent E），同时关闭计时器结束计时
9．记录反应所用的实际时间
10．即刻放入分光光度仪检测，记录样品吸光读数，理想读数为0.1至1.2范围内

三、计算样品活性
计算一：按照操作步骤规定
计算三：（微摩尔/分钟/毫升）换算成（微摩尔/分钟/毫克样品蛋白）

注意事项
1．本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作
2．建议使用核内表达的载体代替胞内表达的载体转染或感染细胞或组织
3．本产品的各项参数达到最优化
4．建议所有操作在无菌状态下进行
5．操作时，须戴手套
6．反应液（Reagent D）避免光照和反复冻融
7．用户可以根据需求按比例调整试剂用量进行样品制备
8．用户可以测定细胞裂解悬液的蛋白浓度，便于计算活性单位之需；建议使用 Bradford蛋白质浓度定量检测试剂盒（G&VS30030.1）
9．如果用户需要测定背景空对照，可以完全按照活性检测的操作步骤进行，唯一变化在于100微升样品改成100微升裂解液（Reagent B）替代
10．如果用户测得背景空对照，计算活性时，勿忘（样品吸光读数－背景空对照读数）
11．反应孵育时间的理想范围为10分钟至60分钟内；或以出现亮黄色显色为限：低于5分钟表明酶活性过高，建议稀释样品，否则影响检测精度；大于60分钟表明酶活性较低，建议增加样品量，最好不要增加孵育时间
12．如果增加孵育时间3小时以上，可能产生反应底物的自动水解，影响检测精度
13．如果用户样品有限，转染困难，且酶活性过低，必须大量增加孵育时间，建议使用 β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒（G&VS10060）
14．样品的酶活性吸光值在0.1至1.2 OD单位为理想状态，其酶活性与吸光值成线性正相关；吸光值在0.3至0.9 OD单位为完美状态
15．亮黄色显色的标准为等同于新鲜的LB培养液作为色彩参照，同时作为反应终止的标准
16．反应终止后，即刻进行比色测定
17．比色测定后，比色皿须清洗彻底
18．β-半乳糖苷酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1微摩尔的邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷
19．本公司提供系列β-半乳糖苷酶检测试剂产品

质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号            名称                规格    
G&VS10037.2    动物细胞β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS10037.2A    清理液（Reagent A）              毫升
G&VS10037.2B    裂解液（Reagent B）                毫升
G&VS10037.2C    稀释液（Reagent C）                毫升
G&VS10037.2D    反应液（Reagent D）            毫升
G&VS10037.2E    终止液（Reagent E）                毫升

试剂盒订购信息
产品编号            名称                规格
G&VS10037.1.1    动物细胞β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性化学发光法定量检测试剂盒    20次
G&VS10037.1.2    β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）标准曲线化学发光法测定试剂盒    20次
G&VS10037.1.3    动物组织β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性化学发光法定量检测试剂盒    20次
G&VS10037.2    动物细胞β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS10037.3    动物组织β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS10060.1    动物细胞β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性高质敏感比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS10060.2    动物组织β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性高质敏感比色法定量检测试剂盒    20/100次
G&VS10134.1    动物细胞β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性超敏荧光定量检测试剂盒    20次
G&VS10134.2    动物组织β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性超敏荧光定量检测试剂盒    20次
G&VS50707.1    动物细胞内源性β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50707.2    动物组织内源性β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50708.1    动物细胞内源性β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50708.2    动物组织内源性β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒    20/次
G&VS50709.1    动物细胞内源性β-半乳糖苷酶活性超敏荧光定量检测试剂盒    20次
G&VS50709.2    动物组织内源性β-半乳糖苷酶活性超敏荧光定量检测试剂盒    20次
G&VS50710.1    动物细胞内源性β-半乳糖苷酶活性化学发光法定量检测试剂盒    20次
G&VS50710.2    β-半乳糖苷酶标准曲线化学发光法测定试剂盒    20次
G&VS50710.3    动物组织内源性β-半乳糖苷酶活性化学发光法定量检测试剂盒    20次