CAT#:JW-20-24730
低温运输，-20℃保存

三日疟原虫探针法LAMP试剂盒（含内参）

产品及特点
三日疟原虫（ Plasmodium malariae ）是一种广泛分布于亚洲、非洲和南美洲的疟原虫 ，由卡米洛·高尔基发现于1882年，可引发三日疟，造成频繁的发烧，每次发作间隔时间为72小时。和主要的疟原虫（恶性疟原虫、间日疟原虫）相比死亡率较低，因此对三日疟原虫的快速准确鉴定有重要意义。本公司根据独自开发的探针法LMAP技术，开发了简单快捷的三日疟原虫探针法LAMP检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供DNA样品。
2.恒温扩增，反应设置更加简单。
3.含荧光探针，可以对扩增进行实时荧光检测（需要荧光PCR仪）。
4.检测灵敏性一般比PCR高10倍以上。
5.特异性高，根据三日疟原虫保守序列设计的4条特异引物和1条探针，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
6.一般630分钟内出结果，比PCR快。
7.上样量大，对20 μL的反应体系，最大样品加样量高达到14 μL。
8.内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
9.提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
10.提供内参，便于排除假阴性结果。
11.本产品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
12.本产品足够50次20 μL体系的探针法LAMP扩增。
13.只可用于科研。
规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成份                                                                   编号                  规格       五孔盒包装
4×LAMP MasterMix
（探针法，待加酶）                                           220303a           200μL      0.5mL绿盖管
Bst DNA聚合酶2.0                                              11-220319        50μL       0.5mL红盖管
20×三日疟原虫探针法LAMP引物-探针混合液    yp20-24730        50μL      0.5mL棕色管
三日疟原虫LAMP阳性对照
（1×10E4拷贝/μL）                                           pc20-24730       250μL     0.5mL黄盖管
三日疟原虫LAMP内参对照
（1×10E4拷贝/μL）                                           Ic20-24730       250μL     0.5mL紫盖管
使用手册                                                              20-24730sc      1份           无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂
待测样品。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.用自选方法纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
2.如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照（PC）和一个样品制备阴性对照（NC）。PC用10μL本试剂盒提供的样品阳性对照（1×10E4拷贝/μL）和10μL内参阳性对照（1×10E4拷贝/μL）加一定量的水作为核酸提取阳性对照样品，加水后的总体积必须跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一致。NC用10μL本试剂盒提供的10μL内参阳性对照（1×10E4拷贝/μL）加一定量的水充当，加水后的总体积必须跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一致。。

二、探针法LAMP反应（20μL体系）
3.反应设置：如果有N+2个DNA纯化样品，则最好设置N+4个LAMP扩增，增加的两个反应分别是LAMP扩增阳性对照和LAMP扩增阴性对照。首次使用本试剂盒时，需要将Bst DNA聚合酶2.0全部加入到4×LAMP MasterMix（探针法）中，轻柔颠倒混匀1分钟后再使用。未用完的部分需要放-20℃保存。在N+4个PCR管中分别加入下列成分：
成分                        N+2个样品管    LAM阴性对照    LAMP阳性对照
4×LAMP MasterMix
（探针法，加酶后）        各5 μL        5 μL                    5 μL
20×三日疟原虫
LAMP引物-探针混合液    各1 μL        1 μL                    1 μL
N+2个样品DNA               各14 μL        -                       -
超纯水                                  -             14 μL                     -
三日疟原虫LAMP阳性对照
（1×10E4拷贝/μL）                                                3.5 μL
三日疟原虫LAMP内参对照
（1×10E4拷贝/μL）        -                    -                   3.5 μL
4.如果使用荧光定量PCR仪，则设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集FAM通道和HEX通道的荧光信号。

三、结果分析
5.实验有效性的判断：样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的FAM信号（对应样本）和HEX信号（对应内参）必须有标准的S扩增曲线，样品制备阴性对照的HEX信号（对应内参）必须有标准的S扩增曲线，LAMP阴性对照的FAM信号和HEX信号必须呈现一条平线，没有S曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果上述阳性对照和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。
6.待测样品的结果判断：在实验有效的情况下，才有必要分析代测样品管的荧光信号。如果其FAM荧光信号曲线为S型（无论HEX信号如何），则说明样品为阳性。如果FAM荧光信号为平线则说明待测样品为阴性。如果HEX荧光信号为S曲线，说明代测样品（FAM曲线）为真阴性。如果HEX荧光信号也是平线，说明此样品可能是假阴性，此样品需要重复测试。

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