CAT#:JW-20-31300
低温运输，-20℃保存

猪轮状病毒探针法荧光RT-LAMP试剂盒

产品及特点
猪轮状病毒 (Porcine Rotavirus, PRV)是猪群中最常见的引起腹泻性疾病的主要病原。 幼龄仔猪最为易感，1～4 周龄仔猪发 病率超过 80%，死亡率达 7% ～20%，症状也较严重。同时，由于该病常与其他疾病混合感染，使病情加重，导致死亡率增高，给养殖户带来严重的经济损失。因此PRV的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此，本公司开发了本检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供病毒RNA样品。
2.恒温扩增，可以不需要贵重的荧光PCR等贵重仪器。
3.含探针，可以进一步提高专一性。
4.检测灵敏性可以达到100拷贝/反应左右。
5.特异性高，扩增引物和检测探针均根据猪轮状病毒RNA保守序列设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
6.一般30分钟内出结果，比RT-PCR快。
7.提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
8.提供内参，便于识别假阴性。
9.本产品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
10.上样量大，对20 μL的反应体系，最大样品加样量高达到13μL。
11.内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
12.本产品足够50次20 μL体系的探针法荧光RT-LAMP扩增。
13.只可用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成份                                                                编号             规格           包装
RT-LAMP MasterMix（探针法，待加酶）    211224a        200μL        0.5 mL本色盖
逆转录酶-扩增酶混合液                                211208b        100μL        0.5 mL红盖管
20×猪轮状病毒RT-LAMP
引物探针混合液干粉                                yw20-31300         50次           0.5 mL白盖管
猪轮状病毒RT-LAMP
阳性对照                                      pc31300-AJXXXXX     2.5×10E6拷贝    0.5 mL黄盖管
猪轮状病毒RT-LAMP内参            ic31300-AJXXXXX     5×10E6拷贝        0.5 mL绿盖管
使用手册                                                20-31300sc           1份                      无
注意：首次使用本产品的时候，需要在引物探针混合液干粉管中加入60uL的自备超纯水，在阳性对照管和内参管中分别加入250uL和500uL超纯水，使得阳性对照和内参的浓度均为1×10E4拷贝/μL。这些溶液用后还有剩余的需要放-20℃保存，阳性对照和内参由于是高浓度的模板，容易污染没有模板的Mix、引物探针混合液和水，因此需要在专门的场地进行稀释。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂
待测样品。

使用方法
一、样品RNA的制备
1.用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
2.如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照（PC）和一个样品制备阴性对照（NC）。PC用10μL本试剂盒提供的阳性对照（1×10E4拷贝/μL）加一定量的水充当，总体积必须跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样品体积一样，NC用水替代。
3.N+2个样品的每个样品在纯化前，每个都要加入本试剂盒提供的10uL猪轮状病毒RT-LAMP内参（1×10E4拷贝/μL），相当于每个样品在进行核酸纯化前，含有1×10E5个拷贝的内参分子。
二、探针法荧光RT-LAMP反应（20μL体系）
4.注意：第一次使用一个新的试剂盒时，必须先将100uL逆转录酶-扩增酶混合液全部加入到RT-LAMP MasterMix（探针法，待加酶）中，盖上盖子后轻柔颠倒1分钟混匀，然后再取用。
5.反应设置：如果有N+2个RNA纯化样品，则最好设置N+5个RT-LAMP扩增，增加一个阴性对照、一个内参扩增对照和一个阳性对照。在N+5个PCR管中加入下列成分：
成分                              N+2个样品管    扩增阴性对照    扩增阳性对照    扩增内参对照
RT-LAMP MasterMix
（探针法，已加酶）         各6 μL                   6 μL                   6 μL                   6 μL
20×猪轮状病毒
RT-LAMP引物混合液        各1 μL                   1 μL                    1 μL                    1 μL
N+2个样品RNA                各13 μL                    -                       -    
超纯水                                -                                                      13 μL                    -    
猪轮状病毒RT-LAMP
阳性对照（1×10E4拷贝/μL）                                                                           13 μL    
猪轮状病毒RT-LAMP
内参（1×10E4拷贝/μL）        -                                                       -                        13 μL
6.本产品含两种探针，故在设置荧光PCR仪时，设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集FAM和HEX两个通道的荧光信号。FAM是样本探针的荧光标记，HEX是内参探针的荧光标记，淬灭基团均是TAMRA。

三、结果分析
7.判断实验有效性：扩增阴性对照必须没有FAM信号的扩增（扩增是指Ct在40以内，荧光信号呈现标准的S型扩增曲线。任何一个不满足此两个条件，均判读为无扩增。下同），扩增阳性对照必须有FAM信号的扩增，否则整个实验无效，需要分析原因。扩增阴性对照如果有扩增，表示实验试剂或环境有模板DNA的污染。扩增阳性对照没有FAM信号的扩增表示试剂盒或扩增设备或操作有问题，需要分别排查。找到原因并解决问题后方可重启实验。
8.如果实验有效，则可以分析N+2个样品的情况。
情况1、FAM信号有扩增，则此样品应判为阳性，不论HEX信号有无扩增。
情况2、样FAM信号无扩增，但HEX信号有扩增，则此样品应判为阴性；
情况3、FAM信号和HEX信号均无扩增，此样品应判为假阴性（可能原因之一是此样品中有抑制物，也可能核酸在纯化过程中丢失）。此样品需要稀释不同倍数后再测或/和重新进行核酸制备。

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