活体组织氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒产品说明书

主要用途
活体组织氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂二氯荧光乙酰乙酸盐，在组织氧化损伤条件下，产生荧光，来定量检测组织内活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适宜于活体动物组织的分析。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。2',7'-二氯荧光乙酰乙酸盐（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）一种完全自由通过细胞膜的染色剂。一旦被过氧化氢、过氧化基、过氧亚硝基阴离子等氧化，便产生绿色荧光。据此测定组织细胞内活性氧族的浓度。

产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
染色液（Reagent B）        毫升
稀释液（Reagent C）        毫升
产品说明书        1份

保存方式
保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备
50毫升锥形离心管：用于组织收集的容器
15毫升锥形离心管：用于工作液配制和组织处理的容器
1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器
6孔细胞培养板：用于组织染色的容器
培养箱或恒温水槽：用于染色孵育
荧光显微镜：用于观察荧光组织
96孔板：用于荧光检测的容器
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于组织荧光定量检测

实验步骤
方法一：新鲜组织薄片定性检测
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的15毫升锥形离心管，加入xx毫升稀释液（Reagent C)，混匀后，将染色工作液置入暗室里。然后进行下列操作。
1．手术取出动物组织
2．放进预冷的50毫升锥形离心管
3．加入xx毫升清理液（Reagent A）浸泡15秒
4．用镊子取出组织，用无菌绵纸吸干
5．即刻用刀片切离组织为1cm X 1cm大小的片状组织
6．用镊子将组织薄片放进6孔培养板的一个孔
7．加入xx毫升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液
8．放进37℃培养箱孵育20分钟，避免光照（注意：如果组织薄片较厚，可以增加孵育时间至60分钟）
9．小心抽去染色工作液
10．加入xx毫升清理液（Reagent A）
11．用镊子将组织薄片放在载玻片上
12．压片
13．即刻在荧光显微镜下观察（定性检测）：激发波长490nm，散发波长520nm――绿色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高

方法二：组织匀浆定量检测
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化。移取xx微升稀释液（Reagent C）到新的1.5毫升离心管，放进37℃恒温水槽里预热，然后加入10微升染色液（Reagent B），混匀后，将染色工作液置入暗室里。然后进行下列操作。
1．手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量
2．移取1克组织，放进预冷的50毫升锥形离心管
3．加入xx毫升的清理液（Reagent A）
4．用镊子取出组织，用无菌绵纸吸干
5．即刻用刀片切碎组织
6．放进一个预冷的15毫升锥形离心管
7．加入xx毫升预冷的稀释液（Reagent C）
8．涡旋震荡5秒，充分混匀
9．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
10．在冰槽里用研磨棒匀化组织（注意：切莫过度匀化）
11．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
12．置入冰槽里备用
13．移取5微升组织匀浆物进行蛋白定量检测：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒（G&VS30030.1）
14．移取xx微升组织匀浆物（样品）或xx微升稀释液（Reagent C）（背景对照）到1毫升石英比色杯里
15．加入xx微升升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液
16．上下倾倒混匀
17．放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照
18．即刻放进荧光分光光度仪检测：激发波长490nm，散发波长520nm——（样品RFU-对照RFU）＝实际RFU：增加，表明活性氧族（ROS）含量高
 
方法三：组织匀浆微量检测
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，移取xx微升稀释液（Reagent C）到新的1.5毫升离心管，放进37℃恒温水槽里预热，然后加入xx微升染色液（Reagent B），混匀后，将染色工作液置入暗室里。然后进行下列操作。
1．手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量
2．移取200毫克组织，放进预冷的15毫升锥形离心管
3．加入xx毫升的清理液（Reagent A）
4．用镊子取出组织，用无菌绵纸吸干
5．即刻用刀片切碎组织
6．放进一个预冷的15毫升锥形离心管
7．加入xx毫升预冷的稀释液（Reagent C）
8．涡旋震荡5秒，充分混匀
9．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
10．在冰槽里用匀浆棒匀化组织（注意：约20至40下）
11．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
12．置入冰槽里备用
13．移取5微升组织匀浆物进行蛋白定量检测：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒（G&VS30030.1）
14．移取50微升组织匀浆物（样品）或xx微升稀释液（Reagent C）（背景对照）到96孔板里
15．加入xx微升升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液
16．放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照
17．即刻放进荧光酶标仪检测：激发波长490nm，散发波长520nm——（样品RFU-对照RFU）＝实际RFU：增加，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事项
1．本产品为20次（1克组织）、100次（200毫克组织）、500次（200毫克组织；96孔板）或40次（组织薄片）操作
2．建议使用新鲜组织，手术切除后1小时内的样品
3．操作时，须戴手套
4．孵育时，须避免光照
5．如果组织薄片较厚，可以增加孵育时间至60分钟
6．组织匀浆时，切莫过度
7．建议组织染色完成后，即刻进行荧光定量或定性分析
8．本公司提供阳性对照甲萘醌溶液，观察组织荧光增强现象
9．本公司提供系列活性氧检测试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定荧光清晰

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                    规格    
G&VS10016.4    活体组织氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒    40/100次
G&VS10016.4A    清理液（Reagent A）                毫升
G&VS10016.4B     染色液（Reagent B）                毫升
G&VS10016.4C     稀释液（Reagent C）                毫升
G&VS12041    Menadione Solution（1mM）            毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                        规格
G&VS10016.1    细胞内氧化应激活性氧（ROS）高质绿色荧光测定试剂盒    20次
G&VS10016.2    细胞内氧化应激活性氧（ROS）初级绿色荧光测定试剂盒    100次
G&VS10016.3    活体组织氧化应激活性氧（ROS）高质绿色荧光测定试剂盒    8/20次
G&VS10016.4    活体组织氧化应激活性氧（ROS）初级绿色荧光测定试剂盒    40/100次
G&VS10016.5    冰冻切片氧化应激活性氧（ROS）高质绿色荧光测定试剂盒    50次
G&VS10016.6    冰冻切片氧化应激活性氧（ROS）初级绿色荧光测定试剂盒    50次
G&VS10016.7    真菌/酵母细胞内氧化应激活性氧（ROS）高质绿色荧光测定试剂盒    20次
G&VS10016.8    真菌/酵母细胞内氧化应激活性氧（ROS）初级绿色荧光测定试剂盒    50次
G&VS10016.9    植物细胞内氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒    20次
G&VS10016.10    植物细胞内氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒    50次
G&VS10016.11    体液氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒        50次
G&VS10016.12    体液氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒        50次