CAT#:JW-19-2029
低温运输，-20℃保存

夜来香花叶病毒、黄瓜花叶病毒及烟草花叶病毒三重探针法qRT-LAMP试剂盒（不含内参）

产品及特点
夜来香花叶病毒（Telosma Mosaic Virus, TelMV）属于马铃薯Ｙ病毒属，基因组全长9689 nt；烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus, TMV）属于植物杆状病毒科烟草花叶病毒属，基因组全长为6395 nt；黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus, CMV）属于雀麦花叶病毒科、黄瓜花叶病毒属；它们都是正义单链RNA 病毒。TelMV寄主范围相对较广，能侵染夜来香、印尼广藿香、翅果铁刀木和西番莲，并广泛分布在东亚和东南亚国家，主要表现为花叶，导致广藿香叶片产量和叶片中的油含量迅速下降。CMV侵染植物产生的症状随寄主的改变而改变，常见的症状有花叶、皱缩、黄化和植株矮化，还有系统坏死等。TMV主要通过汁液摩擦传播，同时也通过蚜虫、土壤以及种子传播，主要是侵染烟草时表现出黄绿相间的花叶症状，严重时形成疱斑。TelMV、TMV及CMV对农业生产造成巨大危害，因此快速灵敏诊断TelMV、TMV及CMV具有重要意义。为此本公司以探针法qRT-LMAP技术为基础，开发了TelMV、TMV及CMV的qRT-LAMP三重检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供病毒RNA样品。
2.恒温扩增，反应设置更加简单。
3.含荧光探针，可以对扩增进行实时荧光检测（需要荧光PCR仪）。
4.检测灵敏度一般比RT-PCR高10倍以上。
5.特异性高，引物是根据TelMV、TMV及CMV的RNA序列保守区域设计的，不会跟其他其他生物的RNA发生交叉反应。
6.一般30分钟内出结果，比qRT-PCR快。
7.提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
8.上样量大，对20 mL的反应体系，最大样品加样量高达到14 mL。
9.内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
10.本产品足够50次20 mL体系的探针法qRT-LAMP扩增。
11.只可用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成份                                                                编号    规格    包装
RT-LAMP MasterMix（探针法待加酶）    220305a    200 mL    0.5 mL本色盖
逆转录酶-扩增酶混合液                           220305b    100 mL    0.5 mL红盖管
20×TelMV、TMV及CMV探针法qRT-LAMP引物-探针干粉    yp19-2029    50次    0.5 mL白盖管
TelMV、TMV及CMV
阳性对照（1E7拷贝/mL）                        pc2029    250 mL    0.5 mL黄盖管
荧光PCR专用模板稀释液                       180701       1 mL    1.5 mL绿盖管
使用手册                                                19-2029sc    1份    1份
注意：引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入55 mL的超纯水充分混匀和再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂
待测样品。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以1E1-1E6拷贝/mL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的RNA片段作为阳性对照。如果需要RNA阳性样品，需要另外订购。
1.标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
2.用带芯枪头分别加入45 mL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在6号管中加入5 mL 1E7拷贝/mL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1E6拷贝/mL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5 mL 1E6拷贝/mL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E5拷贝/mL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5 mL 1E5拷贝/mL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E4拷贝/mL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
7.用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
8.如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照（PC）和一个样品制备阴性对照（NC）。PC用10 mL本试剂盒提供的阳性对照（1E7拷贝/mL）加一定量的水充当，总体积必须核酸纯化试剂盒所要求的起始样品体积一样，NC用水替代。
三、探针法qRT-LAMP反应（20 mL体系）
9.注意：第一次使用一个新的试剂盒时，必须先将100 mL逆转录酶-扩增酶混合液全部加入到qRT-LAMP MasterMix（探针法，待加酶）中，盖上盖子后轻柔颠倒1分钟混匀，然后再取用。如果只做1次重复，则标记N+9个RT-LAMP管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-LAMP阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。
10.反应设置：如果有N+2个RNA纯化样品，则最好设置N+4个qRT-LAMP扩增，增加qRT-LAMP阴性对照和qRT-LAMP阳性对照各1个。在N+4个qRT-LAMP个管中加入下列成分：
成分            N+2个样品管    qRT-LAMP    阴性对照    qRT-LAMP阳性对照
qRT-LAMP MasterMix
（探针法，加酶后）        各6 mL    6 mL    6 mL
20×TelMV、TMV及CMV探针法qRT-LAMP引物-探针混合液    各1 mL    1 mL    1 mL
N+2个样品RNA        各13 mL    -    -
超纯水            -    13 mL    -
TelMV、TMV及CMVqRT-LAMP
阳性对照（1E7拷贝/mL）    -    -    13 mL
11.本产品必须使用荧光PCR仪器进行扩增。设置60次循环，每次循环65℃保温1分钟，采集FAM通道的荧光信号。
四、结果分析
12.若只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct值必须没有读数，或者大于或等于40。样品制备阳性对照和qRT-LAMP阳性对照必须有荧光对数增长，有标准的S扩增曲线，Ct值应该小于40。样品制备阴性对照和qRT-LAMP阴性对照Ct值必须没有读数、大于或等于40，如果小于40则为阳性。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。
13.若把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。

关联产品
TelMV、TMV及CMV荧光定量RT-PCR试剂盒